鄭 藝 李 慧 吳 進 王 芳 吳 佳 蔡 霈

湖南省婦幼保健院藥學部，湖南長沙 410008

藥物性肝損傷是急性肝損傷的常見類型，臨床上最常見的肝損傷藥物是非甾體類抗炎藥，如對乙酰氨基酚，過量服用會導致嚴重肝損傷[1-2]。近年來，天然產(chǎn)物作為抗炎、抗氧化劑在預防和治療藥物性肝損傷方面引起了臨床上的廣泛關注[3-5]。地膚子是黎科植物地膚的干燥成熟果實，其功效為清熱利濕，祛風止癢等[6]。近年研究提示，地膚子對多種病原微生物（真菌、原蟲等）具有抑制作用[7-11]，地膚子總黃酮（flavonoid of Fructus Kochiae，F(xiàn)FK）有抗氧化活性，可有效清除自由基、阻斷脂質過氧化反應[12-14]。本研究通過建立對乙酰氨基酚誘導小鼠急性肝損傷模型，探討FFK 對對乙酰氨基酚導致急性肝損傷的保護作用，初步揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，SPF 級，共36 只，雌雄各半，體重（20±2）g，1 月齡，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物合格證號：NO.110727201100771981。將小鼠飼養(yǎng)于湖南師范大學醫(yī)學院實驗動物中心SPF 級屏障環(huán)境中，實驗室溫度控制在（22±2）℃，濕度控制在60%～80%，給予小鼠人工光照，明暗周期為12 h，小鼠自由進食及飲水。

1.1.2 藥品及試劑 對乙酰氨基酚（批號：HR8155W1）購自寶雞晨光生物有限公司，聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠，批號：191202，規(guī)格：1.5 mg/丸）；谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）（貨號：C009-2-1，批號20200910）、谷草轉氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）（貨號：C010-2-1，批號：20200824）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（貨號：A003-1-2，批號：20200914）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（貨號：A001-3-2，批號：20201015）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。地膚子購自湖南新匯制藥股份有限公司（批號：200201），地膚子符合《中華人民共和國藥典》一部[6]的各項規(guī)定。

1.1.3 儀器設備 恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司，SEN-COW201）；低溫高速高速離心機（Eppendorf-5424R）；DP72 奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)；RT-6100 酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；LeicaRM2235型萊卡石蠟切片機（德國萊卡）；XS205 型電子天平（德國梅特勒-托利多，精密度為萬分之一）。

1.2 研究方法

1.2.1 FFK 的制備 將地膚子中藥材進行粉碎處理，采用80%乙醇回流提取2 h 后，經(jīng)D101 大孔樹脂60%乙醇進行富集，減壓干燥。隨后應用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 反應體系，以蘆丁作為標準品，測得FFK 含量為85.64%[15]。

1.2.2 分組及給藥 實驗動物適應性喂養(yǎng)5 d，按隨機數(shù)字表法將其分為FFK 低、中、高劑量組（75、150、300 mg/kg）和陽性藥對照組（聯(lián)苯雙酯，150 mg/kg）、空白對照組（等量生理鹽水）、對乙酰氨基酚模型組（等量生理鹽水），每組6 只。連續(xù)灌胃給藥7 d 后，空白對照組腹腔注射生理鹽水（0.1 ml/10 g），其余各組腹腔注射對乙酰氨基酚（350 mg/kg）建立小鼠急性肝損傷模型。24 h 后摘眼球取血，收集肝臟浸泡于4%多聚甲醛中。

1.2.3 肝功能指標的測定 血液樣本以3000 r/min 離心15 min 分離血清，離心半徑為15 cm。采用微板法，按照試劑盒說明書，測定GPT、GOT 水平。酶標儀檢測510 nm 處各孔吸光度值，根據(jù)標準曲線計算各組血清中GPT 和GOT 水平。

1.2.4 肝臟組織MDA、SOD 含量的測定 取約0.2 g 的小鼠肝臟左葉，于低溫中加入生理鹽水制成10%肝勻漿，3000 r/min 離心20 min，離心半徑為15 cm，取上清于-80℃分裝保存。按相應試劑盒說明書測定小鼠肝組織中MDA、SOD 含量。

1.2.5 肝臟病理組織切片觀察 取4%多聚甲醛中固定的小鼠肝臟組織，采用乙醇梯度脫水后，進行石蠟包埋，使用切片機將其切成5 μm 厚度，放置于載玻片上，予二甲苯脫蠟，酒精梯度后，蘇木精-伊紅染色。于200 倍光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清指標及肝臟指標比較

對乙酰氨基酚模型組GPT、GOT、MDA 水平高于空白對照組，SOD 低于空白對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。FFK 低劑量組各指標與對乙酰氨基酚模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。FFK中、高劑量組GPT、GOT、MDA 水平低于對乙酰氨基酚模型組和FFK 低劑量組，SOD 高于對乙酰氨基酚模型組和FFK 低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。FFK 組中、高劑量組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組血清指標及肝臟指標比較（）

表1 各組血清指標及肝臟指標比較（）

注 與空白對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05；與FFK 低劑量組比較，cP ＜0.05。FFK：地膚子總黃酮；GPT：谷丙轉氨酶；GOT：谷草轉氨酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

2.2 各組肝臟病理分析

空白對照組可見肝細胞排列緊密，肝竇無明顯擴張或擠壓；未見明顯的炎癥改變。對乙酰氨基酚模型組肝臟組織大面積壞死，大量肝細胞胞核固縮深染、碎裂或溶解，并伴有粒細胞浸潤。陽性對照藥組肝臟組織出現(xiàn)大量肝細胞顆粒變性，細胞腫脹，中等面積壞死。FFK 低劑量組可見肝臟組織絕大部分壞死，大量的肝細胞胞核碎裂或溶解，壞死灶內可見粒細胞浸潤。FFK 中劑量組肝臟組織部分可見壞死灶，部分肝細胞胞核碎裂或溶解，壞死灶內可見少量的粒細胞浸潤。FFK 高劑量組可見肝臟組織小葉內局部可見壞死灶，并伴有少量的粒細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組肝臟組織病理切片（蘇木精-伊紅染色，200×）

3 討論

對乙酰氨基酚在肝內通過CYP 系統(tǒng)代謝產(chǎn)生毒性產(chǎn)物N-乙酰-對-苯醌亞胺，促進肝細胞氧化應激損傷，導致血清中GPT、GOT 顯著升高[16-18]。MDA 是體內氧化應激標志物，而SOD 是機體重要的抗氧化酶，其活性降低時機體內自由基含量上升，可導致肝細胞損傷[19-22]。

地膚子性味甘苦寒，具清熱利濕之功。已有研究報道，地膚子能夠用于治療慢性肝炎及無癥狀乙型肝炎病毒攜帶者[23-24]。本研究采用腹腔注射對乙酰氨基酚建立急性肝臟損傷模型，對乙酰氨基酚模型組肝臟大面積壞死，大量肝細胞碎裂或溶解，并伴有粒細胞浸潤，血清GPT、GOT 明顯升高，提示對乙酰氨基酚誘導小鼠肝臟發(fā)生嚴重損傷。本研究顯示，F(xiàn)FK 中、高劑量組可顯著降低對乙酰氨基酚肝損傷模型小鼠血清中GPT、GOT 的含量，提示一定劑量的FFK 對肝損傷具有較好的保護作用。同時本研究還顯示，F(xiàn)FK能顯著降低對乙酰氨基酚肝損傷小鼠肝組織中MDA含量，同時提高肝組織中SOD 活力，提示FFK 保護肝臟的機制可能是增強機體的抗氧化能力。小鼠肝臟病理學結果顯示，F(xiàn)FK 能夠保護肝細胞形態(tài)結構完整，減輕肝細胞變性壞死程度，與類似研究結果基本一致[25-27]。

綜上所述，本研究提示一定劑量的FFK 對對乙酰氨基酚導致的小鼠急性肝損傷模型具有較好的保護作用，可終止小鼠機體自由基反應，減少肝臟MDA堆積，增強肝臟SOD 活性。FFK 很可能是通過清除自由基、抗脂質過氧化而起到保護受損肝細胞的作用。