劉嘉祺 翟鳳國(guó) 高金霞 劉佳維 楊旭東 周福波 李孟全

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理教研室，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，黑龍江牡丹江 157011；4.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011

乳腺癌是導(dǎo)致患者死亡的常見婦科惡性腫瘤[1-2]，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。蛋白磷酸酶1D（protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta，PPM1D）為一種癌基因，在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，發(fā)揮重要作用[3-5]。miR-195 為非編碼RNA 分子[6-7]，調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程[8-10]。而miR-195 在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中扮演著什么樣的角色？miR-195 與靶基因的調(diào)控作用怎樣?目前相關(guān)報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)觀察人乳腺癌細(xì)胞miR-195 和PPM1D 表達(dá)，探討miR-195 對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制，旨在為乳腺癌的發(fā)生機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)：11995）；胎牛血清（貨號(hào)：SV30087）；胰蛋白酶消化液（貨號(hào)：C0201）；蛋白酶抑制劑（貨號(hào)：P1005）；細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：P0013）；中國(guó)上海碧云天生物公司；SYBR qPCR Mix，RtqPCR Kit（貨號(hào)：FSQ-101）；日本東洋紡（上海）生物科技有限公司；X-treme GENE siRNA（貨號(hào)：04476093 001），瑞士羅氏公司；DAPI 染色液（貨號(hào)：E-IR-R103），中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司；TUNEL 試劑盒（貨號(hào)：11684817910），瑞士羅氏公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 復(fù)蘇，細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，37℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，適量胰蛋白酶消化細(xì)胞，補(bǔ)足培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MCF-7 轉(zhuǎn)染

MCF-7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)MCF-7 組；miR-195 mimics組（MCF-7 轉(zhuǎn)染miR-195 擬似物）；miR-195 inhabitor組（MCF-7 轉(zhuǎn)染miR-195 抑制劑）；陰性對(duì)照NC 組（MCF-7 轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)陰性對(duì)照序列negative control，NC）。轉(zhuǎn)染過(guò)程避光進(jìn)行，36 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種于96 孔板中，各實(shí)驗(yàn)組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。MTT 溶液（20 μl/孔）培養(yǎng)箱中孵育4 h。隨后加150 μl 二甲基亞砜，室溫?fù)u床振蕩10 min。490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值。

1.5 DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法（TdT-mediatedduTP nick end labeling，TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)細(xì)胞，將滅菌后的玻片鋪于24 孔板中，每孔加入500 μl 細(xì)胞懸液。孵育48 h 后處理細(xì)胞，參照TUNEL 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）檢測(cè)蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用刮刀刮下，2500 r/min，4℃離心10 min。棄上清，每份樣品加入RIPA 和蛋白酶抑制劑，冰上超聲破碎。經(jīng)10%丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉，室溫?fù)u床2～3 h，孵育一抗PPM1D 和β-actin，4℃孵育過(guò)夜。洗膜，室溫孵育熒光二抗，再洗膜?？偟鞍滓驭?actin 作內(nèi)參，紅外熒光掃描系統(tǒng)檢測(cè)，odyssey 軟件進(jìn)行光密度積分值分析。

1.7 qRT-PCR 法檢測(cè)miR-195 表達(dá)

qRT-PCR 包括總RNA 提取，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 三部分。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×RT buffer 2 μl，RT Enzyme mix 0.5 μl，Primer mix 0.5 μl，Random 引物1 μl，總RNA 0.5 μg，Nuclease-Free Water 將反應(yīng)體系補(bǔ)至10 μl。PCR反應(yīng)體系：SYBR 混合體系10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，cDNA 1 μl，Nuclease-Free Water 7 μl 補(bǔ)足至20 μl。PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，U6 為內(nèi)參，ABI Prism?7500 fast 儀器設(shè)置40 個(gè)循環(huán)。miR-195-5p 正向引物5’-GCGCGTAGCAGCACAGAAA-3’，反向引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；U6 正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證靶向調(diào)控作用

將HEK293 細(xì)胞接種于96 孔板，24 h 后轉(zhuǎn)染miR-195 mimics 或陰性對(duì)照NC 及含miR-195 結(jié)合PPM1D 3’UTR 序列或突變序列的質(zhì)粒，48 h 后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系miR-195 表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果，MCF-7 組miR-195 表達(dá)低于MCF-10A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 不同細(xì)胞系PPM1D 表達(dá)

WB 結(jié)果，MCF-7 組PPM1D 蛋白表達(dá)高于MCF-10A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

2.3 miR-195 對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖和凋亡影響

MTT 結(jié)果，miR-195 mimics 組細(xì)胞活力明顯低于MCF-7 組，miR-195 inhabitor 組細(xì)胞活力高于MCF-7 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖3。TUNEL 結(jié)果，miR-195 mimics 組細(xì)胞凋亡率明顯高于MCF-7 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；miR-195 inhabitor 組細(xì)胞凋亡率低于MCF-7 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖4～5。

圖4 TUNEL 染色圖像顯示綠色為凋亡細(xì)胞，為DAPI 染色細(xì)胞核（40×）（n=3）

圖5 TUNEL 結(jié)果（n=3）

2.4 miR-195 對(duì)PPM1D 調(diào)控作用

通過(guò)TargetScan 等miRNA 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，預(yù)測(cè)miR-195 可能調(diào)控的靶基因。Has-miR-195-5p 的5’端有能夠與PPM1D mRNA 3’非翻譯區(qū)（untranslated area，UTR）互補(bǔ)區(qū)域，提示miR-195 可能在轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控PPM1D 基因表達(dá)。見圖6。

圖6 預(yù)測(cè)miR-195 與PPM1D 3’UTR 之間結(jié)合位點(diǎn)

攜帶含有PPM1D 基因片段miR-195 mimics 組熒光素酶的活性低于MCF-7 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；攜帶含有突變PPM1D 基因片段miR-195 mimics 組與MCF-7 組熒光素酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖7。

圖7 miR-195 對(duì)PPM1D mRNA 3’UTR 調(diào)控作用（n=3）

3 討論

微RNA 與多種癌癥發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[11-13]，其中miR-195 在癌細(xì)胞中表達(dá)異常[14-19]，扮演著關(guān)鍵角色。PPM1D 為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是一種重要的腫瘤蛋白[20-23]，對(duì)許多重要的腫瘤抑制途徑具有負(fù)調(diào)控作用[24-25]。在本實(shí)驗(yàn)中，MCF-7 組miR-195 表達(dá)低于MCF-10A 組，而PPM1D 蛋白表達(dá)高于MCF-10A 組。MCF-7 轉(zhuǎn)染miR-195 mimics 后，細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著增高；轉(zhuǎn)染miR-195 inhabitor 后，細(xì)胞活力明顯增高，細(xì)胞凋亡率降低。提示miR-195 對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡有一定程度影響。本文進(jìn)一步探究miR-195 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡作用機(jī)制。通過(guò)查詢，PPM1D mRNA 的3’端有miR-195 可結(jié)合的序列。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，PPM1D 是miR-195 直接作用的靶點(diǎn)。

綜上，MCF-7 中miR-195 與PPM1D 呈負(fù)相關(guān)，miR-195 可能通過(guò)直接靶向PPM1D mRNA 的3’-UTR，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡，這也是其調(diào)控機(jī)制的一部分，對(duì)于乳腺癌發(fā)病過(guò)程中所涉及miR-195正向作用或PPM1D 反向作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。