王一帆 許 慧 雷貴月 黃 歆 田寅魁 孟娜娜 朱坤杰

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000

血管性癡呆（vascular dementia，VD）根據(jù)病因分類，包括隱匿性、缺血性、出血性、腦血管病合并阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）等，具有病因復(fù)雜、異質(zhì)性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。我國60 歲及以上AD 患病率約為3.99%，其中VD 患病率約為0.85%，僅次于AD[2]，一旦測(cè)出基本上是隱匿性VD 晚期，對(duì)家庭和社會(huì)都會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。臨床上主要使用簡易精神狀態(tài)檢查（mini-mental state examination，MMSE）和臨床特征進(jìn)行診斷。MMSE 主要是用于檢測(cè)AD，而AD 和VD 在神經(jīng)精神特征上存在很大重疊[3-4]，所以對(duì)VD 的檢測(cè)準(zhǔn)確率不高，故尋找一個(gè)簡便易于操作的方法尤為重要。本研究以Morris 水迷宮潛伏期指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合癡呆程度相關(guān)的血液生化特征性指標(biāo)，構(gòu)建早期預(yù)測(cè)VD 的數(shù)學(xué)模型，旨在為實(shí)驗(yàn)性VD 動(dòng)物模型的早期診斷及干預(yù)提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1.1 主要儀器與試劑

Morris 水迷宮系統(tǒng)（上海移數(shù)信息科技有限公司）；移液槍（德國Eppendorf 公司）；真空采血管（瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）；5%水合氯醛（廣州沛瑜生物科技有限公司）；75%乙醇（廣州沛瑜生物科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠40 只，鼠齡3～5 個(gè)月，雄性，體重（175±25）g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[SCXK（遼）2015-0001]。飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK（黑）2016-001]。飼養(yǎng)期間自由飲水，飼喂普通維持飼料（沈陽茂華生物科技有限公司）。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，溫度控制在22～25℃。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠VD 模型分組與復(fù)制

將40 只大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、假手術(shù)組，每組20 只。采用黃文革等[5]改良的方法復(fù)制VD 模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法每組各選5 只，用作預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證，其余各15 只用作預(yù)測(cè)模型建立。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力指標(biāo)檢測(cè)

大鼠造模12 周后參考周嬌嬌等[6]Morris 水迷宮動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平的檢測(cè)方法，觀察其行為學(xué)差別，通過潛伏期反映大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[7]。當(dāng)兩組潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），提示造模成功[8-9]。

1.2.3 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

在動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，采用腹主動(dòng)脈采血法對(duì)兩組大鼠進(jìn)行血液采集。用5%水合氯醛（0.35 ml/100 g）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后，仰臥位固定，在腹正中線位置“V”字型剪開腹部皮膚，暴露內(nèi)臟，腹壁脊柱兩側(cè)找尋腹主動(dòng)脈。用真空采血管收集4 ml 血液，采集結(jié)束后立即前往齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院送檢，檢測(cè)得到大鼠42 項(xiàng)血液生化指標(biāo)。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型建立

1.2.4.1 預(yù)測(cè)模型初建立及多重共線性檢測(cè) 以大鼠血生化指標(biāo)為解釋變量，潛伏期為因變量，建立多重線性回歸模型并進(jìn)行多重共線性檢驗(yàn)[10]。

假設(shè)有n 個(gè)自變量，那么本研究的模型為：

其中hθ（x）為潛伏期，xn為各血生化指標(biāo)，θ0為常數(shù)，θn為各自變量系數(shù)。

將第m 個(gè)自變量作為因變量，對(duì)剩下的n-1 個(gè)自變量回歸得到擬合優(yōu)度R21-n/m，那么第m 個(gè)自變量的方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）為：

當(dāng)VIFm的值越大時(shí)，說明第m 個(gè)自變量和其他變量的相關(guān)性越大。本研究定義回歸模型的VIF 值為：

當(dāng)VIF>10 時(shí)，即回歸方程存在多重共線性。

1.2.4.2 LASSO 回歸 為避免在變量過多時(shí)采用普通最小二乘估計(jì)帶來的過擬合和多重共線性問題，本研究將進(jìn)行LASSO 回歸，識(shí)別出模型中不重要的變量，將其回歸系數(shù)壓縮為0，達(dá)到使模型簡化及變得可估計(jì)的目的。

LASSO 的損失函數(shù)J（θ）為：

1.2.4.3 多重線性回歸模型建立 將LASSO 回歸篩選后的指標(biāo)進(jìn)行最終多重線性回歸，得出大鼠預(yù)測(cè)模型。

1.2.4.4 多重線性回歸模型檢驗(yàn) 將驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的10 只大鼠，采取上述實(shí)驗(yàn)步驟得到相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，代入預(yù)測(cè)模型，得出潛伏期，與實(shí)際潛伏期進(jìn)行誤差分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 及MATLAB 2020 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)量資料不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示。多重線性回歸分析，以VIF>10 作為指標(biāo)篩選先決條件。通過LASSO 回歸對(duì)血生化指標(biāo)進(jìn)行篩選。將顯著變量納入多重線性回歸并構(gòu)建預(yù)測(cè)模型。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)

模型組潛伏期（24.415±4.528）s 長于假手術(shù)組潛伏期（18.977±4.593）s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.265，P=0.003）。

2.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

通過血生化檢測(cè)，本研究得到了42 項(xiàng)血液生化指標(biāo)，具體詳見表1。

表1 兩組大鼠血液生化指標(biāo)數(shù)據(jù)結(jié)果[n=15，M（P25，P75）]

2.3 VD 大鼠血液生化特征性指標(biāo)與潛伏期間數(shù)學(xué)模型的建立

2.3.1 預(yù)測(cè)模型初建立及多重共線性檢測(cè)

將上述42 項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，計(jì)算VIF，存在26 項(xiàng)VIF>10 的指標(biāo)。見表2。

表2 共線性診斷

2.3.2 LASSO 回歸

采用LASSO 回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，得到交叉驗(yàn)證的LASSO 擬合MSE（圖1）及LASSO 擬合系數(shù)軌跡圖（圖2）。根據(jù)圖1 最低點(diǎn)確定懲罰值為38.4406，即此時(shí)損失函數(shù)取得最小值，對(duì)應(yīng)的即為最優(yōu)lambda值。根據(jù)圖2 可得到與最優(yōu)lambda 值相交的變量即為模型最終所納入的變量為總蛋白（total protein，TP）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、載脂蛋白A（apolipoprotein A，apo-A）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、CO2、膽堿酯酶（cholines-terase，CHE）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）。

圖1 LASSO 回歸擬合MSE

圖2 擬合系數(shù)軌跡圖

2.3.3 多重線性回歸模型建立

依據(jù)LASSO 回歸篩選出的10 項(xiàng)血液生化指標(biāo)，與能反映大鼠癡呆程度的潛伏期進(jìn)行回歸分析，構(gòu)建VD 大鼠的多重線性回歸預(yù)測(cè)模型。

其中各指標(biāo)VIF 值均<10，模型相關(guān)系數(shù)R=0.852，擬合優(yōu)度R2=0.725，回歸模型統(tǒng)計(jì)量值F=5.016，顯著性P=0.001。

2.3.4 多重線性回歸預(yù)測(cè)模型結(jié)果評(píng)價(jià)

將上述根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法選取的5 只模型組（1～5）和5 只假手術(shù)組（6～10）的大鼠進(jìn)行預(yù)測(cè)模型分析，計(jì)算誤差率，結(jié)果均＜5%。見表3。

表3 多重線性回歸預(yù)測(cè)模型判別及實(shí)際潛伏期結(jié)果

3 討論

VD 是指由腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征[12]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎可致海馬區(qū)供血不足，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶和曠場(chǎng)分析能力顯著下降[13]。通過Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，目前采用最多的指標(biāo)是潛伏期[14-16]。本研究中模型組潛伏期長于對(duì)照組，與王緒平等[17]研究一致。

目前VD 中醫(yī)診斷不夠全面，西醫(yī)主要通過規(guī)避致病危險(xiǎn)因素來預(yù)防VD 發(fā)生，尚沒有明確關(guān)于VD的預(yù)防藥物[18]。若建立數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型，進(jìn)行VD 早期診斷和干預(yù)，對(duì)其防治具有重要意義。本研究通過LASSO回歸將不顯著變量系數(shù)縮減為零，保留顯著變量，減少多重共線性的影響，篩選VD 大鼠血液生化指標(biāo)作為預(yù)測(cè)因子，發(fā)現(xiàn)TP、TBA、TBil、TC、apo-A、HDL-C、TG、CO2、CHE、IgM 均與VD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)，這與既往報(bào)道相符。劉晶靚[19]研究表明低頻電刺激術(shù)治療腦卒中患者，血清中與學(xué)習(xí)記憶能力呈正相關(guān)的TP 顯著升高。華鍵等[20]研究表明HDL-C 水平的升高可防止腦血管疾病病情加重。劉戀等[21]研究表明血漿TC 水平下降使腦血管淀粉樣蛋白積累，加劇認(rèn)知損傷。張麗等[22]研究表明老年缺血性腦卒中患者血清TBil 明顯低于參照組。此外，血清TG 的升高與老年心血管疾病病情加重密切相關(guān)[23-24]。侍洪斌[25]研究顯示血清IgM 與TG 呈正相關(guān)，因此推測(cè)TG、IgM可作為診斷早期VD 的血清學(xué)指標(biāo)。Zou 等[26]研究發(fā)現(xiàn)癡呆患者血漿中CHE 活性顯著降低，其學(xué)習(xí)記憶能力下降。這些都提示上述指標(biāo)對(duì)VD 的早期診斷有指導(dǎo)意義。本研究依據(jù)LASSO 回歸篩選出的10 項(xiàng)血液生化指標(biāo)與潛伏期進(jìn)行回歸分析，構(gòu)建VD 大鼠預(yù)測(cè)模型。模型擬合優(yōu)度較高，提示上述血液生化檢測(cè)指標(biāo)與學(xué)習(xí)記憶水平檢測(cè)指標(biāo)高度擬合，誤差率＜5%提示該模型具有良好的預(yù)測(cè)效能。

綜上，本研究所建立的VD 預(yù)測(cè)模型，既可判斷VD 動(dòng)物模型復(fù)制成功與否，又因檢測(cè)方便快捷，可用臨床患者癡呆風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分代替潛伏期，構(gòu)建其與特征性血液生化指標(biāo)之間的數(shù)學(xué)模型，有望為臨床VD 患者早期預(yù)測(cè)及干預(yù)提供參考。本研究在正式開展前已進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了預(yù)判，同時(shí)正式實(shí)驗(yàn)初期對(duì)大鼠進(jìn)行了初篩，本研究模型預(yù)測(cè)出的潛伏期與實(shí)際潛伏期存在一致性。因此本研究在未來將開展更大的樣本實(shí)驗(yàn)，專注于臨床VD 患者血液生化指標(biāo)的檢測(cè)及其疾病進(jìn)展的研究。