扈丹丹 楊志浩 高亞麗 蔣 蕾 王 娜 劉肖瑩

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶 163319

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死[1]。天然產(chǎn)物作為一種有效、副作用小的藥物逐漸被臨床重視，白藜蘆醇、姜黃素等在保護(hù)和治療心血管疾病方面起到重要作用[2-3]。姜黃素是姜黃發(fā)揮藥理作用重要的活性成分[4-7]，具有抗炎、保護(hù)肝臟及抗癌等作用[8-12]。此外，姜黃素具有心肌保護(hù)作用[13-15]，但姜黃素水溶性差，生物利用度低，限制了應(yīng)用[16-17]。脂質(zhì)體（liposome，LIP）和納米乳劑等納米制劑是促進(jìn)姜黃素釋放的優(yōu)良載體制劑[18-20]?？筩TnI 抗體修飾的脂質(zhì)體具有心肌靶向性[21-22]，本研究旨在探討cT-Cur-LIP 將姜黃素聚集于靶區(qū)并發(fā)揮治療心肌梗死的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[許可證：SCXK（吉）2018-0007，合格證：201900031031]，動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)，已通過(guò)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)（大慶）倫理審查；大鼠心肌細(xì)胞H9c2 購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。H9c2 細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，37℃、5%CO2。

1.2 藥物與試劑

姜黃素（純度＞98%）458-37-7（北京伊諾凱科技有限公司，P1671481）；抗cTnI 抗體（1.0 mg/ml）（北京安諾倫生物科技有限公司，QTS20190103）；蛋黃卵磷脂[艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，AL18001]；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，DSPE-PEG2000[艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，B50845]。

1.3 儀器

粒度電位分析儀（英國(guó)Malvern instruments 公司，Zetasizer Nano S90）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 有限公司，CytoFLEX S）；酶標(biāo)儀（美國(guó)博騰儀器有限公司，SYNERGY/HTX）；DeltaVision 顯微鏡系統(tǒng)（美國(guó)GE 有限公司，DeltaVision Ultra）。

1.4 抗cTnI 抗體修姜黃素脂質(zhì)體（anti-cTnI antibody modified curcumin liposome，cT-Cur-LIP）的制備

1.4.1 LIP 的制備 膽固醇、DSPE-PEG2000、蛋黃卵磷脂、三氯甲烷溶解。避光旋蒸，生理鹽水水化。超聲200 W，10 s，間隔5 s，20 次，220 nm 濾膜過(guò)濾，即得。

1.4.2 Cur-LIP 的制備 按照“1.4.1”的方法，成膜時(shí)加姜黃素。

1.4.3 抗cTnI 抗體修飾脂質(zhì)體(anti-cTnIantibody-liposome，cT-LIP)的制備 DSPE-PEG2000-MAL 3.3 mg 溶于1 ml 4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]緩沖溶液中。50 μl 抗cTnI 抗體溶于1 ml HEPES 緩沖溶液中。將兩者等體積混合，4°C 12 h，得DSPEPEG-MAL-cTnI。透析30 min。將DSPE-PEG2000-MAL-cTnI 與等體積的LIP 37°C 孵育2 h，得cT-LIP。

1.4.4 cT-Cur-LIP 的制備 按照“1.4.3”的方法，將DSPE-PEG2000-MAL-cTnI 與等體積的Cur-LIP 37°C孵育2 h，得cT-Cur-LIP。

1.4.5 cT-Cur-LIP 粒徑和電位的測(cè)定 馬爾文激光粒度分析儀測(cè)定電位，平均粒徑，重復(fù)3 次。

1.4.6 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的包封率測(cè)定 姜黃素脂質(zhì)體破膜后測(cè)得的濃度為C1，未處理測(cè)得的姜黃素脂質(zhì)體濃度為C2，重復(fù)3 次。包封率（%）=（C1/C2）×100%。

1.4.7 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的釋放率測(cè)定 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)24 h 透析外液的吸光度，代入以姜黃素濃度梯度為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出該時(shí)間點(diǎn)釋放率，重復(fù)3 次。

1.4.8 穩(wěn)定性 將Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 分別取1 ml 至標(biāo)品瓶中，同時(shí)在4℃避光條件下第0、1、7、15天拍照對(duì)比，觀察其穩(wěn)定性。

1.5 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）檢測(cè)法

將細(xì)胞接種貼壁后，缺氧培養(yǎng)3 h，分別加入濃度為13、20、27、40、54 μmol/L 的Cur、Cur-LIP 和cTCur-LIP。24 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8，2 h 后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，重復(fù)3 次（體外實(shí)驗(yàn)在缺氧條件下，模擬體內(nèi)心肌缺血生理環(huán)境，構(gòu)建細(xì)胞模型）。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)同上后，加入Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，避光2 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，重復(fù)3 次。

1.7 活細(xì)胞工作站

細(xì)胞培養(yǎng)同上，用Hoechst 33258（10 g/L）染核和Dio（6 g/L）染膜，5 min，加入Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，間隔15 s，30 min，電子顯微鏡成像。

1.8 TTC 染色

SPF 級(jí)Wistar 大鼠40 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，將40 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP，每組10只。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支法建立心肌梗死模型，若心電圖可見(jiàn)Ⅱ?qū)?lián)ST 段呈弓背向上，較術(shù)前抬高0.2 mV 以上即可認(rèn)為造模成功。尾靜脈注射Cur-LIP和cT-Cur-LIP，每2 天1 次，持續(xù)2 周。心臟組織切片，2%TCC 染色20 min。觀察變化。

1.9 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法

取離體心臟同上。4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋12 h，干燥3 h。脫蠟，染色，封片，24 h 后熒光成像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cT-Cur-LIP 的表征

2.1.1 特征考察 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 包封率分別是（87.98±1.09）%和（89.94±1.67）%，24 h 釋放率分別是（65.06±0.14）%和（62.68±5.73）%。各粒子粒徑、電位見(jiàn)表1。

表1 各組粒徑及電位（，n=3）

表1 各組粒徑及電位（，n=3）

注 cT-Cur-LIP：抗cTnI 抗體修姜黃素脂質(zhì)體

2.1.2 cT-Cur-LIP 的表征 cT-Cur-LIP 如圖1 所示，表面形態(tài)規(guī)整，呈橢圓形。

圖1 cT-Cur-LIP 的電鏡圖

2.1.3 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的穩(wěn)定性考察 圖2分別為Cur-LIP、cT-Cur-LIP 在4°C 避光條件下放置15 d，在第0、1、7、15 天觀察溶液澄清無(wú)沉淀。

圖2 Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的穩(wěn)定性

2.2 細(xì)胞存活率

藥物濃度為27 μmol/L 時(shí)，cT-Cur-LIP 心肌細(xì)胞存活率高于Cur，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 對(duì)H9c2 細(xì)胞的毒性（n=3）

2.3 測(cè)定藥物的攝取

cT-Cur-LIP 攝取量高于Cur 和Cur-LIP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 Cur、Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 的攝?。╪=3）

2.4 觀察藥物的攝取

圖5 顯示，cT-Cur-LIP 在心肌細(xì)胞中富集，而Cur-LIP 在心肌細(xì)胞中聚集較少。

圖5 心肌細(xì)胞對(duì)Cur-LIP 和cT-Cur-LIP 攝取

2.5 cT-Cur-LIP 治療心肌梗死大鼠的效果

2.5.1 TTC 染色 假手術(shù)組心臟切片全部呈現(xiàn)深色；心肌梗死組基本為白色；Cur-LIP 組大部分呈白色，小部分為深色；cT-Cur-LIP 組大部分呈深色，小部分為白色。見(jiàn)圖6。

圖6 TTC 染色驗(yàn)證cT-Cur-LIP 對(duì)心肌梗死的療效

2.5.2 HE 染色 假手術(shù)組心肌組織的形態(tài)和細(xì)胞核大小一致，纖維排列均勻，胞漿橫紋清晰；模型組胞漿橫紋消失，形成深淺不一的橫帶，核碎裂溶解；Cur-LIP 組胞漿橫紋消失，細(xì)胞核固縮；cT-Cur-LIP 組心肌細(xì)胞的纖維排列均勻，胞漿橫紋清晰，但局部橫紋消失。見(jiàn)圖7。

圖7 HE 染色驗(yàn)證cT-Cur-LIP 對(duì)心肌梗死的療效

3 討論

本研究結(jié)合抗體介導(dǎo)的藥物傳遞系統(tǒng)原理，設(shè)計(jì)了一種心肌靶向的納米靶向制劑[23]。cTnI 作為心肌梗死的黃金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物，僅在心臟損傷時(shí)才會(huì)特異性表達(dá)[24-25]，將抗cTnI 抗體偶聯(lián)的磷脂衍生物嵌入到姜黃素脂質(zhì)體，即得到cT-Cur-LIP。體內(nèi)結(jié)果顯示，cTCur-LIP 可以有效地靶向缺血心肌，明顯提高心肌梗死大鼠的治療效果，但是姜黃素對(duì)于心肌梗死的治療機(jī)制仍需進(jìn)一步探究[26]。