孔文平，李 裕，郭錦材，李 燦，朱湘成,5，陳同強(qiáng),*

（1.中南大學(xué)湘雅國(guó)際轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)聯(lián)合研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410083；2.長(zhǎng)沙市口腔醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；3.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410111；4.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；5.組合生物合成與天然產(chǎn)物藥物湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

真菌是農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)中的主要微生物污染源之一，普遍存在于食品的生產(chǎn)、加工、包裝、貯藏和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)。真菌毒素則是真菌污染后所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)毒性、致癌性、神經(jīng)毒性和免疫抑制等作用，會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重威脅[1]。目前已被發(fā)現(xiàn)的真菌毒素約有400 種，全球約25%的農(nóng)作物受到真菌毒素污染的影響，每年由真菌毒素造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元[2]。與食品和農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)的真菌毒素主要包括赭曲霉毒素、伏馬菌素、黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素等，常見真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 常見真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of common mycotoxins

赭曲霉毒素是全球公認(rèn)在食品和動(dòng)物飼料中最常見的污染物之一，根據(jù)其特征官能團(tuán)的不同，可以分為赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、OTB、OTC和OTD，OTA是赭曲霉毒素家族中毒性最強(qiáng)的成員，不僅可抑制人類胚胎干細(xì)胞的吸附、存活和增殖，還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡和氧化應(yīng)激，被國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)列為“2B”類致癌物[3]。由于OTA理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易被降解破壞，在很多食品，如谷物、咖啡、葡萄酒、干果、堅(jiān)果等食物中都有檢出[4]，為此世界很多國(guó)家都出臺(tái)了食品中OTA含量的限量標(biāo)準(zhǔn)[5-6]（表1），其中：歐盟規(guī)定，嬰幼兒食品中OTA含量不超過0.5 μg/kg，谷物制品和未加工谷物中OTA含量分別不超過3.0、5.0 μg/kg；中國(guó)規(guī)定，谷物、豆類和咖啡豆中OTA含量均不超過5.0 μg/kg，葡萄酒和速溶咖啡中OTA含量分別不超過2.0、10.0 μg/kg；國(guó)際食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）規(guī)定，小麥、大麥和黑麥原糧中OTA含量不超過5.0 μg/kg。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)OTA的防控研究主要集中于OTA的定性和定量檢測(cè)，采用的檢測(cè)方法主要包括薄層色譜法[7]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]、HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、酶聯(lián)免疫法[10]和核酸適配體法[11]等，但是上述方法不僅操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度低，而且只能靶向于OTA本身，無法在食品或農(nóng)產(chǎn)品被污染前進(jìn)行有效預(yù)警，從而避免造成經(jīng)濟(jì)損失。

表1 國(guó)內(nèi)外食品中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Chinese and international limit standards for OTA in food

相較于對(duì)真菌毒素本身的檢測(cè)，直接對(duì)產(chǎn)毒真菌進(jìn)行檢測(cè)能夠前置化干預(yù)其對(duì)食品的污染及對(duì)人類、動(dòng)物的危害，能夠在產(chǎn)毒真菌污染食品早期、未產(chǎn)生毒素前發(fā)現(xiàn)問題，以便及時(shí)采取措施。食品中產(chǎn)毒真菌鑒定方法有形態(tài)學(xué)觀察和生化鑒定等，前者存在需要對(duì)真菌純化培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣、主觀依賴性強(qiáng)、專業(yè)性要求高和靈敏度低等缺陷。也有研究者使用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)產(chǎn)毒真菌進(jìn)行鑒定，而這需要非常完備的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，但是產(chǎn)毒真菌的多樣性給數(shù)據(jù)庫的建立帶來巨大挑戰(zhàn)，因此亟需一種快速、高效的產(chǎn)毒真菌鑒定方法來保障食品真菌污染方面的質(zhì)量與安全。

乳制品因其富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受到全世界各國(guó)人民的喜愛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在過去的25 年中，世界乳制品總產(chǎn)量增長(zhǎng)37.5%[12]。而世界各國(guó)人民生活水平的提高使得各類乳制品的消費(fèi)量在未來相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間將依舊保持穩(wěn)定增長(zhǎng)，市場(chǎng)上可供選擇的乳制品種類也會(huì)越來越多，如含有益生菌的乳制品越發(fā)受到消費(fèi)者的歡迎，但是其在生產(chǎn)過程中可能受到其他真菌的污染，產(chǎn)生一些真菌毒素，如OTA類化合物。為了保證乳制品等食品的安全，需要對(duì)OTA的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的真菌測(cè)序完成，真菌毒素的生物合成途徑被闡明[13-14]。本研究基于基因探針掃描技術(shù)建立更加高效、準(zhǔn)確的方法對(duì)乳制品中OTA的污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，在OTA產(chǎn)生的源頭進(jìn)行有效監(jiān)控，旨在彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法在OTA檢測(cè)中存在的缺陷，更好地保障消費(fèi)者的健康和安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛乳 湖南省長(zhǎng)沙市某大型超市。

共選擇6 株食品中常見的真菌，其中：赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、土壤伊莎酵母（Issatchenkia terricola）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來源于上海保藏生物技術(shù)中心，生長(zhǎng)于馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基；串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）來源于北京生物保藏中心，生長(zhǎng)于酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast peptone dextrose agar，YPD）培養(yǎng)基；冠突散囊菌（Aspergillus cristatus）為本實(shí)驗(yàn)室前期從茯磚茶中分離得到的菌株，生長(zhǎng)于40%蔗糖麥芽浸膏（M40Y）培養(yǎng)基。

真菌基因組提取試劑盒 杭州博日科技有限公司，T3 Super Mix、瓊脂糖、DNA Marker 北京擎科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FlexCycler2多功能聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；JY300C凝膠電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因探針設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中搜索有關(guān)赭曲霉毒素生物合成的相關(guān)研究，繪制赭曲霉毒素的生物合成途徑（圖2）。非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）下游由OTAhal（OTA halogenase）基因編碼的鹵化酶可以催化OTB的氯原子加成，這被證明是形成毒性更大的OTA的關(guān)鍵步驟，而OTA隨后可以被進(jìn)一步酯化或羥基化后形成其他赭曲霉毒素衍生物OTC和OTD，因此針對(duì)特異性的鹵化酶基因進(jìn)一步分析研究。Aspergillus steynii3.53、Aspergillus westerdijkiaeCECT 2948、碳黑曲霉（Aspergillus carbonarius）350、黑曲霉（Aspergillus niger）3.39和Penicillium nordicumCBS 110.769為5 株產(chǎn)OTA的不同種真菌，OTA的產(chǎn)量及各自鹵化酶基因的表達(dá)量相關(guān)性均已被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其鹵化酶（OTAhal）氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)分別為MG701897、MG701896、MG701890、MG701892和MG701895[15]。Leptoxyphium fumago和Caldariomyces fumago為2 株含有鹵化酶基因、不產(chǎn)OTA的真菌，其鹵化酶（OTAhal）氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)分別為AJ300448.1和KM575843.1[16-17]。通過MEGA軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，找出OTAhal結(jié)構(gòu)域特異的一段序列區(qū)域（圖3），進(jìn)行兼并引物設(shè)計(jì)：hal-F（5’-GCYGGYATCRCCAGCACCAAGT-3’）和hal-R（5’ATRAACCASACCCAGCCGCTG-3’）。同時(shí)，使用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3’）驗(yàn)證真菌DNA的提取質(zhì)量及真菌種屬類別。

圖2 OTA的生物合成途徑推測(cè)Fig. 2 Hypothesized OTA biosynthesis pathway

1.3.2 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

將購買的菌株進(jìn)行活化后，分別接種在不同的培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)2～3 d。待菌株生長(zhǎng)好后用50 mL離心管收集，4 ℃、5 000 r/min離心收集菌絲體，用蒸餾水清洗除去菌絲表面的培養(yǎng)基。菌絲加液氮研磨成細(xì)粉，采用BioFlux試劑盒進(jìn)行DNA提取，提取流程參考說明書。PCR反應(yīng)體系25 μL，含有DNA模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL和T3 Super PCR Mix 22 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃、2 min，98 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀成像并觀察結(jié)果。

1.3.3 人工污染牛乳檢測(cè)

取1 g在28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)好的赭曲霉菌體，加入1 mL純牛乳，梯度稀釋，在室溫條件下孵育30 min，4 ℃、4 000 r/min離心去除牛乳，用30 mL無菌水清洗菌體，4 ℃、4 000 r/min離心去除上清，重復(fù)多次，直至菌體離心后上清澄清，菌體在液氮中充分研磨，分別取50 mg研磨液，采用1.3.2節(jié)方法提取基因組DNA，用于PCR實(shí)驗(yàn)，剩余DNA保藏在-20 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及繪圖分別采用MEGA 6和Chem Draw 20軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

OTA生物合成過程中的關(guān)鍵酶編碼基因可作為檢測(cè)OTA產(chǎn)生菌的靶標(biāo)基因。目前，OTA的生物合成途徑已基本闡明，主要涉及到3 種酶：首先，乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A在聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）的催化下生成7-甲基蜂蜜曲霉素[13]；其次，NRPS催化苯丙氨酸與7-羧基蜂蜜曲霉素環(huán)連接[18]；最后在OTAhal參與下，OTB加入氯原子形成OTA[14]。雖然PKS和NRPS的編碼基因也可作為基因探針來識(shí)別真菌毒素生物合成基因簇（biosynthesis gene cluster，BGC），但很容易和其他同樣由PKS或NRPS合成的非毒素次級(jí)代謝產(chǎn)物的BGC混淆，產(chǎn)生假陽性結(jié)果[19]，而OTAhal作為催化OTA生成的關(guān)鍵酶，具有一定的特異性，OTAhal是比較理想的靶標(biāo)基因，但是已報(bào)道的OTA產(chǎn)生菌有很多，主要屬于曲霉屬[20]和青霉屬[21]兩大類，它們含有的編碼OTAhal的基因也不完全相同。此外，也存在含有編碼OTAhal的基因、不產(chǎn)OTA的菌株[16]。因此在考慮上述問題的基礎(chǔ)上，通過對(duì)不同的OTAhal編碼基因進(jìn)行多重序列分析比對(duì)（圖3），針對(duì)產(chǎn)OTA菌株中的OTAhal基因序列設(shè)計(jì)特異性引物hal-F/R，對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖3 OTAhal基因相似度比對(duì)分析Fig. 3 Similarity comparison of OTAhal genes in OTA producers and nonproducers

2.2 檢測(cè)特異性

由圖4A可知，所有供試菌株均能擴(kuò)增出ITS目標(biāo)條帶，證明菌株DNA提取良好且均為對(duì)應(yīng)菌株。在此基礎(chǔ)上對(duì)hal基因進(jìn)行PCR，由圖4B可知，只有赭曲霉菌能擴(kuò)增出一條約251 bp的基因條帶，其他菌株未擴(kuò)增出該條帶，證明該引物設(shè)計(jì)的特異性和有效性。黃曲霉菌和串珠鐮刀菌也擴(kuò)增出一些非特異性基因條帶，可能是因?yàn)閔al-F/R本身為兼并引物（引物長(zhǎng)度分別為22、21 bp），且黃曲霉菌和串珠鐮刀菌總基因組太大。但是食品中常見的冠突散囊菌、土壤伊薩酵母和釀酒酵母未擴(kuò)增出任何基因條帶。

圖4 引物ITS1/4（A）和引物hal-F/R（B）對(duì)供試菌株DNA的PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 4 Electrophoresis images of PCR amplification products with primers ITS1/4 (A) and hal-F/R (B)

2.3 檢測(cè)靈敏度

檢測(cè)靈敏度關(guān)系到該方法的實(shí)用性，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括兩方面：一是在純培養(yǎng)條件下，對(duì)不同含量的赭曲霉菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；二是在1 ng赭曲霉菌基因組DNA中添加等量其他5 種菌株基因組DNA進(jìn)行干擾，利用兼并引物hal-F/R進(jìn)行目標(biāo)條帶PCR特異性擴(kuò)增。

由圖5A可知，在赭曲霉菌純基因組DNA條件下，當(dāng)DNA含量高于10-2ng時(shí)，以兼并引物hal-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以檢測(cè)到目標(biāo)條帶，因此該方法的檢出限為10-2ng。由圖5B可知，當(dāng)不同菌株基因組DNA和1 ng赭曲霉菌純基因組DNA混合時(shí)，以兼并引物hal-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同樣可以檢測(cè)到目標(biāo)條帶，因此該方法可以在多種菌干擾的條件下保持高靈敏度，具備推廣到實(shí)際檢測(cè)中的潛力。

圖5 純DNA（A）和混合DNA（B）條件下的靈敏度檢測(cè)圖譜Fig. 5 Sensitivity for detection of pure DNA (A) and mixed DNA (B)

2.4 人工污染牛乳檢測(cè)結(jié)果

為了驗(yàn)證此方法能否快速、準(zhǔn)確檢測(cè)乳制品中赭曲霉毒素產(chǎn)生菌，向牛乳中添加不同量的赭曲霉菌，然后再從中提取基因組DNA，利用ITS1/4引物進(jìn)行ITS目標(biāo)條帶擴(kuò)增。由圖6A可知，基因組DNA提取良好且為赭曲霉菌。在此基礎(chǔ)上利用hal-F/R對(duì)OTAhal基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖6B可知，1 mL牛乳中，即使赭曲霉菌含量只有10-5mg/mL，也能準(zhǔn)確地檢測(cè)出OTAhal基因，進(jìn)而判斷出該乳制品中存在OTA的污染風(fēng)險(xiǎn)。

圖6 引物ITS1/4（A）和引物hal-F/R（B）對(duì)樣品基因組DNA的PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 6 Electropherograms of PCR amplification products of genomic DNA from artificially contaminated sample with primers ITS1/4 (A) and hal-F/R (B)

3 討 論

隨著全世界范圍內(nèi)的食品安全問題越來越受重視，OTA的檢測(cè)限量標(biāo)準(zhǔn)必將越來越嚴(yán)格。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法成本高、靈敏度低，例如：王宇龍等[22]采用基于核酸適配體的側(cè)流層析技術(shù)檢測(cè)花生與葡萄干中OTA，檢出限為0.51 ng/mL；李克等[23]采HPLC檢測(cè)谷物中OTA，檢出限為0.11 μg/kg；孫月等[24]采用HPLC-質(zhì)譜檢測(cè)糧食中的OTA，檢出限為0.25 μg/kg；王興龍等[25]采用穩(wěn)定同位素直接稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄酒中OTA，檢出限為0.10 μg/L。而且上述方法針對(duì)的是已被OTA污染食品的含量檢測(cè)，無法在OTA污染前作出相應(yīng)的預(yù)警，減少經(jīng)濟(jì)損失。本研究所建立的方法可彌補(bǔ)這方面的缺陷，不僅檢測(cè)效率高，而且靈敏度也較高。雖然赭曲霉菌、黃曲霉菌和串珠鐮刀菌出現(xiàn)了一些非特異性條帶，但此問題或許可以通過延長(zhǎng)兼并引物或者縮短延伸時(shí)間來克服。此外，在不增加實(shí)驗(yàn)步驟的前提下，為進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性，還可以在OTA生物合成途徑的其他關(guān)鍵酶編碼基因上設(shè)計(jì)特異性引物，比如PKS和NRPS的相關(guān)區(qū)域，通過多重引物PCR的方法來實(shí)現(xiàn)更高的準(zhǔn)確度。

4 結(jié) 論

通過在OTAhal基因區(qū)域設(shè)計(jì)探針，運(yùn)用PCR技術(shù)有效檢測(cè)出乳制品中OTA產(chǎn)毒真菌，本研究可作為乳制品中OTA潛在污染的快速、準(zhǔn)確評(píng)判方法，為乳制品中OTA的污染提供有效預(yù)警，為保障我國(guó)乳制品安全做出貢獻(xiàn)。