賈 瑋，馬如甜，代春吉，石 琳，莫海珍，2，張 浩，夏曾潤，祁 蒙

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安710021；3.河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康 725000）

硒元素（Se）是人體正常生長發(fā)育過程中所必需的微量營養(yǎng)元素，通過參與谷胱甘肽氧化酶作用而發(fā)揮抗氧化、抗衰老、拮抗有毒有害金屬、預(yù)防心血管疾病等多種重要的生理調(diào)節(jié)功能［1-3］。缺硒會導(dǎo)致機(jī)體功能障礙，引發(fā)各種疾病，如克山病和免疫缺陷疾病等［4-6］?！巴寥?植物-機(jī)體”循環(huán)是人體獲取硒的主要途徑，植物源食品中的硒形態(tài)復(fù)雜，分為無機(jī)硒和有機(jī)硒，硒的不同形態(tài)直接影響食品的營養(yǎng)價(jià)值及安全性。隨著富硒食品中有機(jī)硒含量的增加，硒的營養(yǎng)吸收及轉(zhuǎn)化率逐漸增加［7］。植物源食品中有機(jī)硒形態(tài)包括：硒代氨基酸、硒蛋白、硒多糖、硒多酚等。富硒豆類的種植是富硒產(chǎn)業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈高質(zhì)量發(fā)展的重要抓手，作為豆類中有機(jī)硒的重要組成，硒代氨基酸的準(zhǔn)確定量分析是相關(guān)產(chǎn)品精深加工過程中質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

硒代氨基酸的檢測方法主要為高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法［8-10］、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法［11-13］與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［14-17］。前兩種方法均是將富硒食品中硒代氨基酸經(jīng)強(qiáng)酸消解轉(zhuǎn)化為無機(jī)硒，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間比對實(shí)現(xiàn)硒形態(tài)的鑒定，無法直接提供有機(jī)硒形態(tài)結(jié)構(gòu)信息［18］。硒代氨基酸主要包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸等，其中硒代蛋氨酸是目前已知生物利用率最高的硒化合物。已有研究者采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對綠豆芽、大豆、麥麩中的硒代蛋氨酸進(jìn)行了檢測，但均是使用三重四極桿質(zhì)譜，分辨率較低。本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴型掃描模式，建立了豆類中硒代蛋氨酸（SeMet）的檢測方法，優(yōu)化了超高效液相色譜條件及樣品前處理?xiàng)l件，并對硒代蛋氨酸的碎裂途徑與機(jī)理進(jìn)行了研究。該方法操作簡便，分辨率高，準(zhǔn)確性及重復(fù)性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

綠豆（陜西西安，超市）；富硒綠豆、富硒黑豆、富硒紅豆（陜西安康，湖北恩施）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純，上海山浦化工有限公司）；濃鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白酶、蛋白酶K（Sigma Aldrich 公司）；0.22 μm 微孔濾膜（美國Pall 公司）；乙腈、甲酸、甲酸銨、乙酸、乙酸銨（色譜純，美國Sigma 公司）；硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS號：3211-76-5，純度＞97.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Avnti J-26×PI 型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司）；Vortex.Genie2T 型旋渦混合器（美國Scientific Industries 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；AL204-IC 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SHZ-A 型水浴恒溫振蕩器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；Ultimate 3000-Q-Exactive 型超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道離子阱質(zhì)譜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Milli-Q Integral型純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg（精確至0.01 mg）于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈-水溶液（1∶1，體積比）溶解并定容至刻度，得到100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于棕色密閉瓶-20 ℃避光保存。準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈-水溶液（1∶1）稀釋，配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取空白樣品，經(jīng)前處理后得到基質(zhì)提取溶液，用其逐級稀釋硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到一系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL Tris-HCl（30 mmol/L，pH 7.5）緩沖溶液，渦旋混勻，水浴超聲30 min，加入10 mg胰蛋白酶，37 ℃恒溫水浴振蕩酶解4 h，然后加入10 mg 蛋白酶K，50 ℃恒溫水浴振蕩酶解4 h，在4 ℃條件下，10 000 r/min 離心20 min。取上清液于離心管中，加入等體積的乙腈，靜置10 min 后以10 000 r/min 離心20 min（4 ℃），取上清液，用乙腈-水溶液（1∶1）按體積比1∶3稀釋，過0.22 μm微孔濾膜后上機(jī)測定。

1.5 分析條件

色譜條件：Hypersil GOLD HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo Fisher Scientific 公司），流動相A：0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸6 mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B：0.2%甲酸6 mmol/L甲酸銨乙腈溶液，pH值為2.86；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。梯度洗脫程序：0～2 min，95%～80%B；2～4 min，80%～60%B；4～8 min，60%B；8～9 min，60%～95%B；9～10 min，95%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化（ESI），采用正模式；鞘氣流速：18 L/min，輔助氣流速：3 L/min；毛細(xì)管電壓：正離子模式3 500 V；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃。全掃描模式（Full scan）下，分辨率為70 000 FWHM，自動增益控制的目標(biāo)值（AGC）為1.0×106，掃描范圍為m/z70～400，最大注入時(shí)間為100 ms。二級掃描方式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴掃描模式（Full MS/dd-MS2），分辨率為35 000 FWHM，自動增益控制的目標(biāo)值為1.0×105，觸發(fā)時(shí)間（Apex trigger）為3～6 s，動態(tài)背景扣除為10.0 s，選擇TOP 5 模式。待碎裂的目標(biāo)分析物相關(guān)信息在Inclusion list 中設(shè)定，保留時(shí)間為4.11 min，質(zhì)荷比為198.002 78，當(dāng)待碎裂的離子響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到強(qiáng)度閾值2.9 × 104時(shí)，即送往高能碰撞解離池（HCD），在碰撞能量10 eV條件下進(jìn)行碰撞，得硒代蛋氨酸碎裂片段的質(zhì)荷比為180.976 46、151.997 53。

2 結(jié)果與討論

2.1 超高效液相色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選擇Hypersil GOLD 柱（100 mm × 2.1 mm，5 μm）和Hypersil GOLD HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，1.9 μm）兩種不同選擇性的色譜柱進(jìn)行硒代蛋氨酸的分離。Hypersil GOLD 色譜柱的固定相為鍵合長鏈烷基的多孔硅膠，載碳量為10%，疏水性較強(qiáng)；Hypersil GOLD HILIC 色譜柱的固定相為強(qiáng)親水性的極性吸附劑，載碳量為6%。結(jié)果表明，Hypersil GOLD HILIC 色譜柱對硒代蛋氨酸的保留能力比Hypersil GOLD 色譜柱強(qiáng)，且目標(biāo)化合物的色譜峰響應(yīng)值較Hypersil GOLD 色譜柱高（圖1）。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Hypersil GOLD HILIC色譜柱做進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 硒代蛋氨酸經(jīng)不同色譜柱及流動相分離的色譜峰響應(yīng)值（n=6）Fig.1 Peak response values of selenomethionine separated by different chromatographic columns and mobile phases（n=6）

流動相攜帶待測物質(zhì)經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜，在去溶劑的同時(shí)形成帶電離子，因此流動相組成不僅會影響目標(biāo)物的保留時(shí)間和峰形，還會影響離子化效率及響應(yīng)值［19］。實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動相緩沖體系對硒代蛋氨酸分離效果、峰形及響應(yīng)強(qiáng)度的影響。對比了4 種不同的流動相緩沖體系，分別為0.2%甲酸+4 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液、0.2%甲酸+6 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液、0.2%甲酸+8 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液、0.2%乙酸+6 mmol/L 乙酸銨+水/乙腈溶液。結(jié)果顯示，以0.2%甲酸6 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液為流動相時(shí)，硒代蛋氨酸的分離效果最佳，峰形尖銳且不拖尾，響應(yīng)值最高（圖1）；使用其他流動相緩沖體系時(shí)存在峰前沿、峰拖尾、峰寬等問題。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.2%甲酸6 mmol/L甲酸銨水溶液和0.2%甲酸6 mmol/L甲酸銨乙腈溶液作為流動相。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

硒代蛋氨酸在豆類中主要以結(jié)合形式存在，本研究采用酶解法進(jìn)行提取。以富硒黑豆中提取的硒代蛋氨酸的色譜峰面積為指標(biāo)，考察了胰蛋白酶、蛋白酶K 及兩者共同使用對樣品中硒代蛋氨酸提取效果的影響。胰蛋白酶與蛋白酶K 均歸類于絲氨酸蛋白水解酶，胰蛋白酶作用于堿性氨基酸殘基的羧基側(cè)，蛋白酶K 的切割活性較廣，作用于芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸的羧基端［20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用兩種酶共同作用于樣品，可斷裂多肽鏈中所有種類的氨基酸，使硒代蛋氨酸更好地游離，得到的色譜峰面積最高，提取效果最優(yōu)。

2.3 硒代蛋氨酸的斷裂途徑與機(jī)理研究

實(shí)驗(yàn)對硒代蛋氨酸進(jìn)行了碎裂片段機(jī)理研究，硒代蛋氨酸的dd-MS2掃描譜圖如圖2A 所示。在ESI正離子模式下，硒代蛋氨酸加氫后形成偶電子離子［21］，分子離子峰為m/z198.002 78［M+H］+，其主要碎裂途徑如圖2B所示。電荷中心位于N原子上的分子離子脫去1分子NH3后形成碎片離子C5H9O2Se+，m/z為180.976 46；或脫去1分子CO，1分子H2O后形成碎片離子C4H10NSe+，m/z為151.997 53。電荷中心位于Se原子上的分子離子經(jīng)γ-H重排后，脫去1分子C3H7NO2形成碎片離子C2H5Se+，m/z為108.955 60；或由正電荷中心引發(fā)i斷裂反應(yīng)后形成碎片離子C4H8NO2+，m/z為102.055 55。

圖2 硒代蛋氨酸的四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜圖（A）及碎裂機(jī)理示意圖（B）Fig.2 UHPLC/ESI-Q-Orbitrap mass spectrum（A）and fragmentation mechanism（B）of selenomethionine

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

豆類為復(fù)雜基質(zhì)，富含的蛋白質(zhì)與脂肪等成分會對硒代蛋氨酸的檢測產(chǎn)生干擾。本實(shí)驗(yàn)通過繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷基質(zhì)效應(yīng)（ME）的強(qiáng)弱。ME=（1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）×100%。ME 絕對值在20%以內(nèi)為較弱基質(zhì)效應(yīng)，在20%～50%為中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)，在50%～100%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。通過計(jì)算得基質(zhì)效應(yīng)為15.75%，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱，因此本實(shí)驗(yàn)通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法進(jìn)行定量分析，以減弱基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

取空白樣品，添加0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 系列水平的硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4”方法進(jìn)行前處理后上機(jī)測定，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)加標(biāo)工作曲線，得到本方法的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)；再分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定檢出限（LOD）及定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，硒代蛋氨酸在0.05～0.5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.997 6，LOD和LOQ分別為0.015 mg/kg和0.05 mg/kg。

2.6 準(zhǔn)確度及精密度

取空白樣品，分別在0.1、0.2、0.4 mg/kg 3 個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照“1.4”方法處理后上機(jī)測定，每個(gè)加標(biāo)水平每日平行測定6 次，連續(xù)測定6 d。結(jié)果顯示，硒代蛋氨酸在3 個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為77.6%～83.2%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDr）為2.8%～4.8%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDR）為4.1%～6.5%（表1），表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表1 綠豆中硒代蛋氨酸的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviations for selenomethionine in mung bean

2.7 實(shí)際樣品的測定

采用本方法對產(chǎn)自陜西安康、湖北恩施的富硒豆類進(jìn)行檢測，得到富硒黑豆、富硒紅豆、富硒綠豆中硒代蛋氨酸的含量分別為0.252、0.163、0.184 mg/kg。圖3為富硒黑豆中硒代蛋氨酸的色譜圖。

圖3 富硒黑豆中硒代蛋氨酸的色譜圖Fig.3 Chromatogram of selenomethionine in selenium-enriched black bean

3 結(jié) 論

本研究建立了基于超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)的豆類中硒代蛋氨酸的檢測方法，對超高效液相色譜條件和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，并對硒代蛋氨酸的碎裂機(jī)理進(jìn)行了研究。方法學(xué)考察及實(shí)際樣品檢測結(jié)果顯示該方法的基質(zhì)效應(yīng)小，準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足豆類中硒代蛋氨酸的檢測需求，有助于推動富硒產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。