張博鈉，侯敏敏，錢承敬，史亞利*，蔡亞岐

（1.國(guó)科大杭州高等研究院（UCAS） 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310024；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

有機(jī)磷酸酯（OPEs）作為阻燃劑或增塑劑廣泛應(yīng)用于橡膠制品、紡織品、電子設(shè)備、家具及建筑材料等消費(fèi)品中［1］。近年來(lái)，部分鹵系阻燃劑（如多溴聯(lián)苯醚），由于其毒性、長(zhǎng)距離遷移性和生物累積性等逐步被淘汰。OPEs 作為替代品，阻燃性能優(yōu)良，產(chǎn)量和使用量逐年增加。OPEs 通常以物理方式而非化學(xué)鍵合的形式添加于各類消費(fèi)品中，穩(wěn)定性較差，因此在消費(fèi)品生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用全過(guò)程均可能通過(guò)揮發(fā)、浸泡溶出或磨損等方式釋放到環(huán)境中［1］。大量研究顯示，目前OPEs 在室內(nèi)外空氣［2-3］、灰塵［4］、沉積物［5］、水體［2］、土壤［6］、生物樣本［7］乃至人體樣本［8］中檢出，表明OPEs 普遍存在于生活環(huán)境中，可能會(huì)威脅人類健康。

研究表明多種OPEs 對(duì)生物體表現(xiàn)出多方面的毒性效應(yīng)，如神經(jīng)毒性［9］、生殖毒性［10］、致癌性［11］、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)［12］等?？紤]到OPEs在環(huán)境中普遍存在，人體會(huì)通過(guò)呼吸、灰塵攝食、皮膚吸收、飲食及飲水等多種途徑攝入OPEs［13］。目前，多項(xiàng)研究通過(guò)采集空氣和灰塵樣品研究人體通過(guò)呼吸和灰塵攝食對(duì)OPEs的暴露，僅有少數(shù)研究評(píng)估了通過(guò)飲食攝入對(duì)OPEs的暴露［14-16］。Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)食用大米是人體暴露OPEs的潛在的主要途徑。糧食及其制品作為人們?nèi)粘ｏ嬍车闹魇吃希紦?jù)人們膳食的重要部分。食用受到污染的糧食可能會(huì)影響人體健康。

進(jìn)入人體的OPEs 能夠發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，生成其二酯代謝物（di-OPEs）或羥基化的產(chǎn)物［17］，最后通過(guò)尿液排出體外，因此通常利用尿液中的OPEs 代謝物作為標(biāo)志物評(píng)估人體對(duì)OPEs 的暴露情況［18］。值得注意的是，先前的研究忽略了人體直接從環(huán)境和飲食中攝入的OPEs 代謝物。然而最近有研究發(fā)現(xiàn)OPEs代謝物本身也存在于食物和灰塵樣品中，如Hou等［19］在淡水魚中檢測(cè)到OPEs代謝物。He等［20］在澳大利亞采集的食物和飲用水樣品中檢出磷酸二丁酯（DBP）和磷酸二苯基酯（DPHP）等di-OPEs。Van等［21］研究證實(shí)了人們可通過(guò)灰塵攝入di-OPEs，表明人體中OPEs代謝物可能直接來(lái)源于飲食或灰塵攝食。

目前已有研究在固體樣品（如糧食和土壤）中檢測(cè)到OPEs 及di-OPEs，通過(guò)使用不同的分析檢測(cè)方法，包括固相萃取聯(lián)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）［20，22］、超聲提取聯(lián)用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）［23］等，但這些研究通常采取不同的前處理方法分別檢測(cè)OPEs 及di-OPEs，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且消耗較多有機(jī)溶劑。因此，建立同時(shí)檢測(cè)糧食樣品中OPEs及di-OPEs的分析方法具有重要意義。

本研究在優(yōu)化萃取凈化前處理?xiàng)l件的基礎(chǔ)上，建立了一種同時(shí)測(cè)定糧食樣品中14種OPEs及其8種di-OPEs的UPLC-MS/MS 法。采用該方法對(duì)采集的25個(gè)小麥樣品中目標(biāo)化合物進(jìn)行測(cè)定，以期了解我國(guó)糧食樣品中有機(jī)磷酸酯及其代謝物的污染水平，并據(jù)此對(duì)我國(guó)成年人和兒童攝入小麥的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BJ-150 型多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；DHG-9023A 烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DP200D-1 氮吹濃縮儀（東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司）；UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；Triple quadTM三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（MS/MS，美國(guó)AB SCIEX 公司）；ENVI-18 固相萃取柱（6 mL/500 mg，Supelco 公司）；HLB 固相萃取柱（6 mL/200 mg，Waters 公司）；0.22 μm 尼龍濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；1 mL 注射器（江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司）。超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；甲醇、二氯甲烷、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

OPEs 單標(biāo)儲(chǔ)備液及其內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L）用乙腈配制，分別量取10 μL 單標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。di-OPEs 單標(biāo)儲(chǔ)備液及其內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L）用甲醇配制，分別量取10 μL 單標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。使用時(shí)，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、2、5、10、20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取一定量的小麥置于干凈玻璃管中，加入5 mL甲醇后，手動(dòng)搖晃20 s，取出清洗液，重復(fù)2次，清洗后的小麥于80 ℃烘干20 min，粉碎成粉末。準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末樣品于15 mL玻璃離心管中，加入質(zhì)量濃度為1 mg/L 的OPEs 及其代謝物的內(nèi)標(biāo)混合溶液各10 μL，靜置老化1 h，再加入3 mL 甲醇，超聲萃取60 min 后，轉(zhuǎn)移上清液；再向殘留部分加入3 mL 甲醇，超聲萃取30 min，重復(fù)2 次，最后將3次上清液合并待凈化。

采用ENVI-18 固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，首先用5 mL 甲醇活化萃取柱，將萃取液直接加載到活化好的小柱上并收集，待樣品加載完成后，再用5 mL 甲醇進(jìn)行洗脫，將收集的洗脫液氮吹至1 mL，通過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待檢測(cè)。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：25 ℃，流速：400 μL/min；流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，B為甲醇。OPEs的梯度洗脫程序：0～1 min，10%～40% B；1～4 min，40%～90% B；4～4.1 min，90%～100% B；4.1～9 min，保持100% B；9～9.1 min，100%～10%B；9.1～13 min，保持10%B。di-OPEs 的梯度洗脫程序：0～0.5 min，保持20%B；0.5～1 min，20%～40%B；1～4 min，40%～90%B；4～7.5 min，保持90%B；7.5～7.6 min，90%～20%B；7.6～12 min，保持20%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 對(duì)于OPEs，離子源：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；氣簾氣壓力：0.14 MPa，碰撞氣壓力：0.02 MPa，離子源噴霧電壓：5 000 V，溫度：600 ℃，霧化氣壓力：0.34 MPa，輔助霧化氣壓力：0.28 MPa。對(duì)于di-OPEs，離子源：電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-）；檢測(cè)方式：MRM；氣簾氣壓力：0.07 MPa，碰撞氣壓力：0.02 MPa，離子源噴霧電壓：-4 500 V，溫度：500 ℃，霧化氣壓力：0.34 MPa，輔助霧化氣壓力：0.34 MPa。其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 14種OPEs及8種di-OPEs的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for 14 OPEs and 8 di-OPEs

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法的優(yōu)化

由于OPEs 及其代謝物的性質(zhì)存在差異，先前研究通常采用不同的凈化方法，對(duì)于OPEs，首先用乙腈和超純水活化ENVI-18 小柱，將換相成水相的萃取液加載到小柱中，上樣完成后負(fù)壓抽干小柱，然后用含有25%二氯甲烷的乙腈溶液進(jìn)行洗脫（方法1）。對(duì)于di-OPEs，首先用甲醇和超純水活化HLB小柱，將換相成水相的萃取液加載到小柱中，上樣完成后負(fù)壓抽干小柱，用甲醇洗脫目標(biāo)物（方法2）。上述兩種凈化方法均需負(fù)壓抽干柱子，耗時(shí)較長(zhǎng)，過(guò)程較繁瑣，且對(duì)于同時(shí)檢測(cè)OPEs 以及di-OPEs 需要處理樣品2次。因此，本研究對(duì)樣品凈化方法進(jìn)行了改進(jìn)，即首先用甲醇活化ENVI-18小柱，然后直接將甲醇相的萃取液加載到活化好的小柱上并收集，然后用甲醇洗脫（方法3）。

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了改進(jìn)前后凈化方法的處理效果（見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，凈化方法1 和3 對(duì)于大部分OPEs均具有較好的回收效果，采用凈化方法1，除TBOEP 外，其余13 種OPEs 的回收率為90.1%～154%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為8.3%～43%；采用凈化方法3，14 種OPEs 的回收率為64.0%～131%，RSD 為0.90%～22%。整體上，采用方法1，TnBP 和TBOEP 的回收率偏高，且RSD 大于方法3。對(duì)于di-OPEs，采用方法2 和3，8 種di-OPEs 的回收率分別為79.2%～112%和71.1%～141%，RSD 分別為5.0%～34%和0.57%～19%。鑒于改進(jìn)后的方法3 對(duì)22 種目標(biāo)化合物均具有較好的回收效果，無(wú)需負(fù)壓抽干小柱，且節(jié)約時(shí)間，因此最終選擇凈化方法3，即將甲醇萃取液直接上樣進(jìn)行凈化。

圖1 不同凈化方法對(duì)14種OPEs（A）與8種di-OPEs（B）的回收率（n=3）Fig.1 Recoveries of 14 OPEs（A）and 8 di-OPEs（B）using different purifying methods（n=3）

2.2 線性范圍、檢出限與定量下限

配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、2、5、10、20 μg/L的14種OPEs和8種di-OPEs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”儀器條件進(jìn)行分析，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L），待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，14種OPEs和8種di-OPEs在0.1～20 μg/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.99。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算方法檢出限（LOD）與定量下限（LOQ），14 種OPEs 的LOD 為0.005 02～1.94 ng/g，LOQ 為0.016 7～6.45 ng/g；8 種di-OPEs 的LOD 為0.005 70～1.00 ng/g，LOQ 為0.018 9～3.33 ng/g（見(jiàn)表2）。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，14 種OPEs 及8 種di-OPEs標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 14種OPEs及8種di-OPEs的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits of 14 OPEs and 8 di-OPEs

圖2 14種OPEs（A）與8種di-OPEs（B）標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of 14 OPEs（A）and 8 di-OPEs（B）standard solutions

2.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以小麥為基質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)以評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度與精密度，向其中添加3 個(gè)不同濃度水平（5、10、20 μg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行3 次，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測(cè)定。由表3 可知，14 種OPEs 的加標(biāo)回收率為60.0%～131%，RSD 為0.89%～22%；8 種di-OPEs 的回收率除BBOEP 外（141%），其它均在62.4%～121%之間，RSD 為0.57%～22%。整體上，該方法的準(zhǔn)確性較好，精密度較高，能夠滿足檢測(cè)要求。

表3 小麥樣品中14種OPEs及8種di-OPEs的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 14 OPEs and 8 di-OPEs in wheat samples（n=3）

（續(xù)表3）

2.4 實(shí)際樣品分析與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用本方法對(duì)25 個(gè)小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。14 種OPEs 的總含量為0.843～23.5 ng/g，中位含量為2.33 ng/g。TEP、TCEP、TCIPP 和EHDPP 在全部樣品中均檢出，TEHP、TPHP、TMPP 和TBOEP的檢出率高于50%。其中，TCIPP是小麥中最主要的OPEs，含量為0.525～2.14 ng/g，中位含量為0.960 ng/g。8 種di-OPEs 的總含量為0.126～4.81 ng/g，中位含量為1.15 ng/g。DBP 和DPHP 在所有樣品中均檢出，BDCPP 和BEHP 的檢出率高于50%。其中BEHP 是小麥中最主要的di-OPEs，中位含量為0.529 ng/g，這可能與其具有直接的工業(yè)應(yīng)用有關(guān)。以上結(jié)果表明OPEs 和di-OPEs 在小麥樣品中普遍存在。

表4 小麥樣品中14種OPEs及8種di-OPEs的檢測(cè)結(jié)果（ng/g）Table 4 Detection results of 14 OPEs and 8 di-OPEs in wheat samples（ng/g）

根據(jù)Zhang 等［14］采用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，本文評(píng)估了我國(guó)成年人和兒童通過(guò)食用小麥對(duì)OPEs 及di-OPEs 的暴露情況。采用下式估算人體每日通過(guò)食用小麥對(duì)OPEs 及di-OPEs 的攝入量：EDI=CW×CFW/BW。其中：EDI 為每日攝入量，ng/kg bw/day；CW為小麥中OPEs 或di-OPEs 的含量，ng/g；CFW為居民日均小麥消費(fèi)量，g/day；BW為人體質(zhì)量，kg。

成人日均小麥消費(fèi)量取自《中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒》［24］，為323 g/day；成人體重取自《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020 年）》中18 歲及以上居民男性（69.6 kg）和女性（59 kg）體重的平均值，為64.3 kg。兒童（3～12周歲）的平均體重為25 kg，日均糧食消費(fèi)量（谷物）為165 g/day［25］。

根據(jù)美國(guó)環(huán)保署（USEPA）的定義，RfD 值代表一種化合物每日經(jīng)口暴露于人體的閾值，被視為人體暴露于非致癌有毒物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要指標(biāo)。對(duì)于我國(guó)成年人和兒童，成年人通過(guò)食用小麥攝入14種OPEs 的總暴露量為4.23～118 ng/kg bw/day，兒童為5.56～155 ng/kg bw/day；成年人通過(guò)食用小麥攝入8 種di-OPEs 的總暴露量為0.633～24.2 ng/kg bw/day，兒童為0.832～31.7 ng/kg bw/day（見(jiàn)表5）。整體上，兒童的暴露量高于成人，TCIPP 是通過(guò)食用小麥每日攝入量最高的OPE，估算的兒童和成人的EDI 中位值分別為6.33、4.82 ng/kg bw/day，BEHP 是通過(guò)食用小麥每日攝入最高的di-OPE，估算的兒童和成人的EDI中位值分別為3.49、2.66 ng/kg bw/day。每種OPEs通過(guò)食用小麥的暴露量比其對(duì)應(yīng)的RfD值低2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，表明存在較低的健康風(fēng)險(xiǎn)。但考慮到糧食的生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸過(guò)程可能會(huì)增加OPEs及其代謝物的污染，進(jìn)而導(dǎo)致人體更高的暴露風(fēng)險(xiǎn)，因此仍需要更多的研究關(guān)注人體通過(guò)飲食對(duì)OPEs及di-OPEs的暴露及相關(guān)的健康風(fēng)險(xiǎn)。

表5 成人和兒童通過(guò)食用小麥攝入的OPEs及di-OPEs估算結(jié)果（ng/kg bw/day）Table 5 Estimation of daily per capita wheat dietary intakes and risk assessment exposure to OPEs and di-OPEs for adults and children（ng/kg bw/day）

3 結(jié) 論

本研究建立了超聲提取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)糧食樣品中有機(jī)磷酸酯及其二酯代謝物的分析方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間和溶劑，經(jīng)過(guò)一次處理即可完成所有目標(biāo)物的濃縮凈化，方法學(xué)考察表明22種目標(biāo)物質(zhì)的回收率良好，重現(xiàn)性高，滿足檢測(cè)要求?；谠摲椒▽?duì)實(shí)際小麥樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8種OPEs和4種di-OPEs普遍存在，暴露估算結(jié)果表明我國(guó)成人和兒童通過(guò)食用小麥攝入的OPEs遠(yuǎn)低于其RfD，健康風(fēng)險(xiǎn)較低。