焦魯楊，張凱林，杜夢穎，許一澄，李樹奇，孔祥蕾，3*

（1.南開大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 元素有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；2.天津理工大學(xué) 生命健康智能檢測研究院，天津 300384；3.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300071）

基于質(zhì)譜的“自頂向下”（Top-down）分析方法在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的興起，為完整蛋白質(zhì)序列鑒定、翻譯后修飾、可變剪接及其關(guān)聯(lián)性研究提供了新的方法［1-2］。蛋白質(zhì)離子的有效裂解是自頂向下質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)。隨著高分辨率、高質(zhì)量精度質(zhì)譜技術(shù)的廣泛使用以及激光技術(shù)的快速發(fā)展，基于光解離的離子活化已逐漸發(fā)展成為研究多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)的重要方法之一［3-4］。在光解離活化中，氣相離子吸收某一特定波長的光子后引發(fā)裂解［5-6］。激光器輸出能量和波長的變化則為光解離活化提供了選擇性和可調(diào)諧性。其中紅外多光子解離（IRMPD）方法已被廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)離子的光解離活化［7-9］。與IRMPD 相比，紫外光解離（UVPD）的解離機(jī)理更為復(fù)雜，并能夠產(chǎn)生不同種類的碎片離子［10-13］。2013 年，Brodbelt 課題組［12］把一臺準(zhǔn)分子激光器與軌道阱質(zhì)譜儀相結(jié)合，將193 nm UVPD 應(yīng)用于自頂向下質(zhì)譜分析，結(jié)果表明該過程中同時存在能量分配前直接解離與重新分配后解離兩種裂解模式。目前，UVPD 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于自頂向下質(zhì)譜分析，如蛋白質(zhì)的剪接及翻譯后修飾［14-16］，突變［17］以及交聯(lián)位點(diǎn)［18］的詳細(xì)研究［19-20］。

考慮到不同活化方式的解離通道和產(chǎn)生的碎片之間的差異，將不同的離子活化方式相結(jié)合進(jìn)行質(zhì)譜分析以其獨(dú)特優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注［21-24］。2014 年，Brodbelt［21］將193 nm UVPD 和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）同時引入軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜儀碰撞池中，這種新的組合活化方法使互補(bǔ)離子對的類型趨于平衡。2018 年，Shaw［22］通過對四極桿軌道阱質(zhì)譜儀進(jìn)行改裝，離子可以選擇性地進(jìn)行電子捕獲解離（ECD）、UVPD 或直接引入碰撞池中，實(shí)現(xiàn)多種活化方式相結(jié)合。雖然大多數(shù)完整蛋白的紫外光解離均使用193 nm 光子，但213 nm 或266 nm 光子也被較多地應(yīng)用于自頂向下的質(zhì)譜分析中。2015 年，Loo等［23］采用UVPD 預(yù)活化核糖核酸酶，發(fā)現(xiàn)266 nm 紫外光子可以裂解蛋白質(zhì)中的多個二硫鍵，結(jié)合ECD 則可進(jìn)一步提高含二硫鍵的蛋白質(zhì)序列覆蓋率。作者還發(fā)現(xiàn)延長UV 和IR 激光脈沖之間的時間有利于近距離二硫鍵重組，表明帶有自由基硫醇的二硫鍵重組發(fā)生在10～100 ms 之間。Philippe 等［24］則通過對Orbitrap 質(zhì)譜儀進(jìn)行改造，將波長為213 nm 的紫外激光和10.6 μm 的二氧化碳激光同時引入，提高了牛泛素蛋白解離碎片的覆蓋率，其中+13 價離子的碎片覆蓋率從單一UVPD 方法的76%提高到組合方法的83%。本文首次將210 nm紫外和3 μm紅外激光相結(jié)合，通過傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（FT-ICR MS）實(shí)現(xiàn)了基于雙光束的離子活化和蛋白質(zhì)自頂向下質(zhì)譜研究，并在優(yōu)化條件下研究了不同價態(tài)牛泛素蛋白離子的光解離質(zhì)譜。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與樣品制備

牛泛素蛋白（Ubi，純度98%，Sigma-Aldrich公司），未經(jīng)純化直接使用；異丙醇（色譜純，安耐吉科技）；乙酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；Mill-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

以水為溶劑制備20 mmol/L Ubi溶液，進(jìn)一步稀釋為1 μmol/L，稀釋后溶液的體積比為水∶異丙醇∶乙酸=49∶49∶2，溶液直接使用。

1.2 儀器條件及實(shí)驗(yàn)方法

所有實(shí)驗(yàn)均在自行搭建的基于FT-ICR MS的共聚焦雙光束光解離質(zhì)譜-光譜系統(tǒng)［25］中開展。如圖1所示，該系統(tǒng)結(jié)合一臺7.0 T FT-ICR MS（IonSpec，Varian Inc.，Lake Forest，CA，USA），兩臺可調(diào)諧光學(xué)參量振蕩（Optical parametric oscillator，OPO）激光器：紫外-可見可調(diào)諧激光器（NT-342C，EKSPLA，Lithuania）和紅外激光器（Firefly-IR，M Squared，UK）。激光照射時間由一臺程序控制的SSH-R 型機(jī)械快門（SSH-C4RA，Sigma-Koki，Tokyo，Japan）來完成。在光解離質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，3 μm紅外激光和210 nm 紫外激光經(jīng)光學(xué)準(zhǔn)直系統(tǒng)調(diào)節(jié)后在空間上共同聚焦于ICR 分析池，通過控制時間序列，分別實(shí)現(xiàn)兩束激光對離子云的同時、分步和交替照射。

圖1 雙光束光解離質(zhì)譜-光譜系統(tǒng)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the double-beam photodissociation mass spectrometry-spectroscopy system

所有離子均通過電噴霧電離源（ESI）電離產(chǎn)生，其中ESI源預(yù)熱溫度設(shè)置在80 ℃。質(zhì)譜檢測均采用正離子模式，質(zhì)荷比（m/z）的探測范圍為220～2 000。使用注射泵（Pump 11 Elite，Harvard Apparatus，USA）將稀釋后的牛泛素蛋白樣品溶液以120 μL/h的速度注入，經(jīng)電噴霧電離后，通過離子導(dǎo)引系統(tǒng)進(jìn)入分析池。進(jìn)一步的光解離質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，通過存儲波逆傅里葉變換［26］的方法在離子回旋共振分析池中選出不同電荷態(tài)的牛泛素蛋白離子，隨后引入相應(yīng)的激光，最后對產(chǎn)物離子進(jìn)行探測和數(shù)據(jù)分析。每張光解離質(zhì)譜圖通過50次累加后獲得。

1.3 光譜數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析由實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)的數(shù)據(jù)分析軟件NKTD 完成［27］。通過采用“由一到多”的方式尋找同位素峰簇的方法，完成對“自頂向下”蛋白質(zhì)組學(xué)中重疊譜峰的自動解析，減少人工干預(yù)。蛋白質(zhì)碎裂產(chǎn)生的所有可能的a，b，c，x，y，z，a-1，b-1，c-1，x-1，y-1，z-1 以及相應(yīng)脫水、脫氨峰均可被識別。通過將程序運(yùn)行結(jié)果進(jìn)行人工對比發(fā)現(xiàn)，信噪比（S/N）取2.5時可獲得最好的譜峰識別效果，即能夠盡可能地獲得更多的碎片離子信號，同時也避免了對噪聲信號的誤讀。

2 結(jié)果與討論

2.1 +11電荷態(tài)牛泛素蛋白的IRMPD、UVPD和雙光束光解離質(zhì)譜分析

基于本課題組自行搭建的雙光束光解離質(zhì)譜-光譜系統(tǒng)［25］，兩束光可以分別或通過重疊、分步或交替的方式共同被引入離子回旋共振分析池中。不同電荷態(tài)前體離子以存儲波逆傅里葉變換的方式選出并存儲在分析池進(jìn)行光解離質(zhì)譜分析。以+11 電荷態(tài)牛泛素蛋白離子為例，實(shí)驗(yàn)中分別采集其IRMPD、UVPD 與雙光束條件下的光解離質(zhì)譜圖。雙光束實(shí)驗(yàn)中，對兩束激光的時間序列進(jìn)行了優(yōu)化研究，分別探究了兩束激光同時照射的不同時間序列組合方式，以及紅外激光和紫外激光分段引入的時間序列組合方式（圖2A～C）。

圖2所示，IRMPD 與傳統(tǒng)的碰撞活化解離（CAD）方法類似，通過斷裂不穩(wěn)定的酰胺鍵（C—N 鍵）產(chǎn)生b、y 類型的離子，與之前的文獻(xiàn)報道一致［28-29］；對于［Ubi+11H］+11（m/z=779.6）前體離子，IRMPD可以觀察到來自b 離子及其相應(yīng)的丟失H2O 碎片離子，但碎片覆蓋率非常有限，僅為8%（圖2A）。UVPD 與IRMPD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯不同，UVPD 產(chǎn)生了93 個碎片離子。［Ubi+11H］+11的UVPD 碎片包括各種類型的離子，其中最重要的碎片離子為a、y、z 離子碎片（圖3）。UVPD 使整體蛋白的覆蓋率提高到65%（圖2B）。對于同一母體離子，采用IR 和UV 雙光束光解離的方法產(chǎn)生的碎片種類則更多，雙光束光解離產(chǎn)生98個碎片離子，碎片覆蓋率達(dá)73%。與UVPD相比，a、b、c、x離子的數(shù)目均有所增加（圖3）。此結(jié)果與Philippe 等［24］在Orbitrap 質(zhì)譜儀的結(jié)果有所不同。在該研究中，雙光束方法產(chǎn)生的a 類型離子比UVPD 顯著減少。這差異也反映出復(fù)雜蛋白質(zhì)離子的能量分配以及解離通道對實(shí)驗(yàn)條件的敏感性。除a/x、b/y、c/z離子外，本實(shí)驗(yàn)還觀測到相應(yīng)離子H2O 和NH3的中性丟失峰，其中中性丟失H2O 比NH3更普遍，這可能是由于質(zhì)子化的酸性基團(tuán)有利于H2O的丟失［30］。

圖3 IRMPD、UVPD以及雙光束光解離產(chǎn)生的不同種類離子分布Fig.3 Distributions of different types of ions，produced by IRMPD，UVPD and the double-beam photodissociation method

上述研究表明，通過先后引入紅外和紫外兩束激光，并保持4 s的共同照射為最佳方案（圖2C）。

圖2 在不同光照射模式下，［Ubi+11H］+11（m/z=779.6）產(chǎn)生的光解離質(zhì)譜圖Fig.2 Photodissociation mass spectra of［Ubi+11H］+11（m/z=779.6）generated under different modes

圖4為［Ubi+11H］+11的IRMPD、UVPD 以及雙光束光解離序列圖。雙光束方法使蛋白離子碎片覆蓋率更高，離子分布更加廣泛。相對于單一的紫外光解離，中部和N 端斷裂產(chǎn)生的碎片離子更多。值得注意的是：UVPD 和雙光束光解離產(chǎn)生的解離位點(diǎn)仍有所不同，且具有一定的互補(bǔ)性，兩者數(shù)據(jù)疊加覆蓋率達(dá)83%，這些結(jié)果優(yōu)于CAD 與UVPD 相結(jié)合所得的結(jié)果，其原因可能是紅外和紫外交替照射可產(chǎn)生具有不同電子和振動激發(fā)態(tài)的蛋白離子并對應(yīng)了不同的解離通道，以及紅外解離的碎片離子會進(jìn)一步被紫外光解離產(chǎn)生新的碎片，從而獲得蛋白質(zhì)離子更高的碎片覆蓋率。

圖4 ［Ubi+11H］+11對應(yīng)的IRMPD，UVPD以及雙光束光解離序列圖Fig.4 Sequence maps of［Ubi+11H］+11 by IRMPD，UVPD and the double-beam photodissociation methods

2.2 其他電荷態(tài)雙光束光解離質(zhì)譜分析

圖5 和圖6 給出了［Ubi+12H］+12（m/z=714.7）和［Ubi+10H］+10（m/z=857.5）兩種離子的雙光束光解離質(zhì)譜圖及序列圖。不同電荷態(tài)離子的碎片覆蓋率有所不同，但與IRMPD、UVPD 相比，雙光束光解離均產(chǎn)生更多的碎片離子，且均以發(fā)生a/x、b/y 斷裂為主，c/z 離子則相對較少。對于［Ubi+12H］+12前體離子，雙光束光解離共產(chǎn)生123個碎片離子，其中包括30個a離子，27個b離子，10個c離子，17個x 離子，27 個y 離子以及15 個z 離子，碎片覆蓋率為68%。［Ubi+10H］+10離子雙光束光解離碎片覆蓋率為47%，其中N 端斷裂和C 端斷裂幾乎產(chǎn)生相同數(shù)目的碎片離子（分別為31 和32）。［Ubi +12H］+12，［Ubi+10H］+10前體離子發(fā)生C—N 鍵斷裂，產(chǎn)生b、y 離子數(shù)目顯著多于其他離子，斷裂主要發(fā)生在中間位點(diǎn)，末端斷裂則相對較少。不同電荷態(tài)的牛泛素蛋白通常能觀察到同一碎片離子，例如在m/z682.632 8、795.650 5處分別觀察到和類型的碎片離子。

圖5 ［Ubi+12H］+12和［Ubi+10H］+10的雙光束光解離質(zhì)譜圖Fig.5 Double-beam photodissociation mass spectra of［Ubi+12H］+12 and［Ubi+10H］+10

圖6 ［Ubi+12H］+12和［Ubi+10H］+10對應(yīng)的雙光束光解離序列圖Fig.6 Sequence maps of［Ubi+12H］+12 and［Ubi+10H］+10，generated by the double-beam photodissociation method

2.3 討 論

通過以上的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，將IRMPD 與UVPD 相結(jié)合，可進(jìn)一步豐富蛋白質(zhì)離子自頂向下質(zhì)譜中的碎片離子的種類，提高碎片分布的序列覆蓋率。此結(jié)果與已有的相關(guān)研究相一致［24］。從實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)來看，除選擇的質(zhì)譜儀和激發(fā)激光波長不同之外，本方案中紅外和紫外激光在時間序列上以部分重疊的方式引入回旋共振池，與Philippe 等［24］采用的雙光束同步照射方案有所不同。另一方面，此實(shí)驗(yàn)中高價態(tài)離子（+11、+12）產(chǎn)生的各種類型離子數(shù)目高于低價態(tài)離子（+10）（圖7），碎片覆蓋率與離子價態(tài)相關(guān)，這與Simon 等［31］基于213 nm UVPD 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。但本實(shí)驗(yàn)仍有許多待改進(jìn)之處，如對經(jīng)由a、x、z離子二次裂解產(chǎn)生的d、v、w離子未進(jìn)行識別、歸屬和研究。同時，由于雙光束方法的靈活性，面向不同價態(tài)離子的結(jié)構(gòu)差異的實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化也需進(jìn)一步研究?？傊疚奶岢龅幕贔T-ICR MS的雙光束光解離方法能夠提供更有效的裂解方式，但在優(yōu)化光解離組合、有效的數(shù)據(jù)分析以及更多自頂向下蛋白質(zhì)質(zhì)譜的具體應(yīng)用上仍需改進(jìn)和更多實(shí)踐。

圖7 不同價態(tài)離子產(chǎn)生的碎片離子分布Fig.7 Distributions of fragment ions with different types generated by different precursor ions

3 結(jié) 論

本文通過結(jié)合3 μm IRMPD 和210 nm UVPD 技術(shù)，將兩束激光在時間序列上以部分重疊的方式引入傅里葉變換離子回旋共振分析池，并研究了不同電荷態(tài)牛泛素蛋白離子的雙光束光解離質(zhì)譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙光束方法能促進(jìn)牛泛素蛋白序列中部和N端斷裂，產(chǎn)生更加豐富的碎片離子。與IRMPD、UVPD 相比，雙光束光解離除了產(chǎn)生更高的碎片離子產(chǎn)率外，還擴(kuò)展了碎片離子在質(zhì)譜低質(zhì)荷比和高質(zhì)荷比區(qū)的分布范圍。進(jìn)一步將雙光束方法和UVPD 方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，可以更好地提高蛋白序列的覆蓋率。從實(shí)際應(yīng)用的角度來看，此方法在優(yōu)化組合和數(shù)據(jù)分析方面仍有較大的提升空間，需進(jìn)一步深入研究。