張思唯 李金奧,2 劉博遠 蔣雨辰 鐘 秋 雷云康 張明月 趙銘欽

（1河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院/河南省香精香料與調(diào)香工程技術研究中心，450002，河南鄭州；2紅云紅河集團昆明卷煙廠，650000，云南昆明；3四川省煙草公司德陽市公司，618400，四川德陽）

雪茄煙作為一種特殊的卷煙產(chǎn)品，具有勁頭大、香氣濃郁和吃味醇厚等特點。由于其抽吸方式與烤煙不同，所以對人體危害較小，近幾年發(fā)展較快[1]。而隨著雪茄煙銷售規(guī)模的增大，國內(nèi)優(yōu)質(zhì)雪茄煙原料質(zhì)量不足，嚴重制約了雪茄煙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。四川什邡是我國雪茄煙的主產(chǎn)地之一，其生態(tài)條件與國外優(yōu)質(zhì)雪茄煙產(chǎn)區(qū)較為接近，但由于發(fā)展起步較晚，尚未形成成熟完備的雪茄煙栽培技術規(guī)程。在日常栽培管理中，當?shù)亟?jīng)常采用扣心和現(xiàn)蕾打頂?shù)拇蝽敺绞?，導致當?shù)匮┣褵熑~片偏大，氮素積累過多，蛋白質(zhì)和煙堿含量升高，煙葉吸食品質(zhì)變差。雪茄煙屬于高氮類型的煙草，含氮化合物的合成和轉(zhuǎn)化對其質(zhì)量和產(chǎn)量有明顯影響[2]，而煙株打頂是煙草栽培中一項重要的技術措施，可及時調(diào)整煙株的養(yǎng)分供應，使光合產(chǎn)物向煙葉內(nèi)部集中分配，促進煙葉內(nèi)部干物質(zhì)積累，增加煙葉有效葉面積[3]，影響煙葉中總氮、蛋白質(zhì)和煙堿等主要化學成分的合成與積累[4]。

氮代謝是煙草生長發(fā)育中的關鍵代謝之一，其代謝強度和協(xié)調(diào)程度會對煙葉品質(zhì)形成起到重要的調(diào)節(jié)作用，并最終影響煙葉質(zhì)量。許威等[5]研究表明，打頂會使煙株充分吸收氮素，用于合成煙堿，導致其煙堿合成能力增強。趙光偉等[6]研究表明，隨著打頂時間的推遲，煙葉內(nèi)糖含量變化呈先上升后下降趨勢。目前，國內(nèi)外對煙葉打頂技術的研究主要集中在其對化學成分和產(chǎn)量的影響，對打頂后煙葉內(nèi)部氮素積累規(guī)律和相關酶活性影響的研究幾乎沒有。因此，本試驗以四川什邡煙區(qū)的德雪3號為試驗材料，研究了不同打頂方式對雪茄煙煙葉打頂后氮代謝關鍵酶活性、煙堿含量、化學成分以及感官品質(zhì)的影響，探討打頂引發(fā)的煙株內(nèi)部氮素積累機制，探究什邡煙區(qū)最適宜的打頂方式，為該地區(qū)優(yōu)質(zhì)雪茄煙煙葉生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料

試驗于2020年在四川省什邡市師古鎮(zhèn)大泉坑村雪茄煙生產(chǎn)基地（104°09′ E，31°18′ N）進行，供試品種為德雪3號。試驗地土壤為水稻土，土壤pH 5.8～7.0、有機質(zhì)3.01g/kg、速效磷38.10mg/kg、速效氮120mg/kg、速效鉀89mg/kg。

1.2 試驗設計

煙苗于 2020年 4月 30日移栽，行株距為120cm×40cm，施氮量為180kg/hm2（煙草專用復合肥，N:P2O5:K2O＝1:0.5:3），共設3個處理，選取田間長勢一致的煙株，分別于現(xiàn)蕾期、初花期和盛花期打頂，分別記為T1、T2和T3處理，打頂時間分別為6月9日、6月12日和6月16日。試驗采用隨機區(qū)組排列，3次重復。各處理分別在打頂后0、5、10、15和20d取中部葉位（自下而上10～12葉位）葉片20片，一部分于液氮罐保存，用于測定氮代謝關鍵酶活性，一部分去除主脈后于105℃烘箱殺青15min，65℃烘干至恒重，將其磨碎過60目篩，用于測定煙堿、總氮、蛋白質(zhì)及常規(guī)化學成分含量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 氮代謝相關酶活性 采用蘇州科銘生物試劑盒，利用紫外分光光度法檢測硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）的活性。

1.3.2 化學成分及氨基酸含量 按照流動分析儀法[7]測定總糖、總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量。采用蘇州科銘生物試劑盒，利用紫外分光光度法檢測氨基酸含量。

1.3.3 煙葉感官質(zhì)量評價 將各處理調(diào)制后的中部葉卷成單料雪茄煙，請評吸專家根據(jù)YC/T 138-1998的方法進行感官質(zhì)量評價。

1.4 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 24.0進行差異顯著性分析，利用 GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對氮代謝關鍵酶活性的影響

NR是植物將體內(nèi)的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關鍵酶，對植物氮代謝起關鍵作用。由圖 1a可以看出，雪茄煙NR活性隨著打頂后天數(shù)的增加呈先上升后下降趨勢，打頂當天T1處理酶活性顯著高于T2和T3處理，各處理均在打頂后5d時達到峰值，這表明雪茄煙在打頂后由于根系吸收氮素能力增強，氮代謝能力增強。打頂后5d時T2處理顯著高于T3處理，之后各處理雪茄煙葉酶活性逐漸下降，在打頂后20d酶活性降到最低，且T2處理顯著低于T1處理，表明雪茄煙在成熟期氮代謝逐漸減弱，煙株由氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化，利于煙葉后期生長發(fā)育。

GS是氨同化的關鍵酶，是植物氮素同化中重要的酶之一。由圖1b可以看出，雪茄煙GS活性隨著打頂后天數(shù)的增加呈先下降再上升再下降趨勢，T1處理在打頂剛開始時酶活性最高，且顯著高于T2和T3處理，隨后劇烈下降，可能是由于過早打頂導致，之后各處理GS活性緩慢下降，且T1處理一直高于T2和T3處理，在打頂后15d時，GS活性緩慢上升，各處理間差異不顯著，在打頂后20d時，各處理酶活性整體下降，可能因為煙葉進入成熟衰老期，導致酶活性整體下降。

GOGAT與GS共同構成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。由圖 1c可以看出，不同處理煙葉的GOGAT活性隨著打頂后天數(shù)的增加呈先上升后下降趨勢，與NR活性變化趨勢一致，表明煙株在打頂初期氮代謝旺盛，隨著打頂后天數(shù)的增加，氮代謝減弱，碳積累增強。煙株在打頂當天T1處理GOGAT活性顯著高于T3處理，與T2處理差異不顯著，在打頂后5d時，T2處理GOGAT活性最高，且與T1和T3處理差異顯著，之后T1處理酶活性一直處于較高水平，T2和 T3處理酶活性較低，可能由于T2和T3處理打頂較晚，煙株較T1處理田間密度小，導致煙葉光合作用增強，氮素積累更多向碳素積累轉(zhuǎn)化。

圖1 不同處理對雪茄煙葉NR、GS和GOGAT活性的影響Fig.1 The effects of different treatments on the activities of NR, GS, and GOGAT in cigar tobacco leaves

2.2 不同處理對雪茄煙煙葉總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)和煙堿含量的影響

由圖 2a可以看出，雪茄煙在打頂后各處理總氮含量均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，在打頂0～5d時，T1處理煙葉總氮含量一直顯著高于T2和T3處理，打頂后15～20d，各處理間無顯著差異，可能是因為葉片干物質(zhì)積累造成煙葉稀釋效應，導致煙葉總氮含量下降。

由圖 2b可以看出，雪茄煙打頂后氨基酸含量變化趨勢與NR活性變化一致，呈先上升再逐漸下降趨勢。打頂后5d煙葉氨基酸含量最高，表現(xiàn)為T2＞T1＞T3，T2與T3處理間差異顯著，與T1處理差異不顯著。之后隨打頂后天數(shù)增加，煙葉逐漸成熟，導致氨基酸含量逐漸下降。在打頂后10～20d，T1處理氨基酸含量始終顯著高于T2和T3處理，T2和T3處理間差異不顯著。

由圖 2c可以看出，蛋白質(zhì)含量在打頂后隨著煙葉生長天數(shù)增加呈緩慢下降趨勢，打頂后 0～5d時，T2處理降幅最大，為9.17%，之后隨著打頂后天數(shù)的增加逐漸趨于平緩，其中T2處理一直顯著高于T1和T3處理。在打頂后20d時，煙葉蛋白質(zhì)含量降到最低，蛋白質(zhì)含量為 T1＞T2＞T3，分別為16.03%、15.78%和14.81%，T1和T2處理間無顯著差異，但顯著高于T3處理。

由圖 2d可以看出，雪茄煙煙堿含量隨打頂后天數(shù)的增加而逐漸增加，在打頂后0～5d，T1處理漲幅最大，為44.9%，其次為T3和T2處理，分別為36.4%和24.3%，這是因為較早打頂和較晚打頂都會導致雪茄煙煙堿急劇增加。打頂后10d時，T2和T3處理顯著高于T1處理，打頂后20d時，T3處理煙堿積累量最多，達3.39%，T2處理次之，T1處理最低，且T1處理顯著低于T2和T3處理，T2和T3處理間差異不顯著，這可能是因為較早打頂導致雪茄煙氮素積累不足，從而煙堿積累較少。打頂過晚氮素由根部向頂部運輸，從而導致煙堿積累量上升。

圖2 不同處理對雪茄煙葉總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)和煙堿含量的影響Fig.2 The effects of different treatments on the contents of total nitrogen, amino acid,protein and nicotine in cigar tobacco leaves

2.3 不同處理對調(diào)制后雪茄煙煙葉化學成分含量的影響

由表1可知，隨著打頂時間的推遲，調(diào)制后雪茄煙的總糖含量呈逐漸下降趨勢，且T1和T2處理顯著高于T3處理，煙堿含量隨打頂時間的推遲呈先上升后下降變化趨勢，T2與 T1處理間差異顯著。蛋白質(zhì)含量隨打頂時間的推遲逐漸下降。韓富根[8]指出，煙草的鉀氯比大于4的情況下，燃燒性較好，本研究中T2處理鉀氯比高于T1和 T3處理。氮堿比在接近1的情況下煙葉質(zhì)量較好，若氮堿比增大，煙葉顏色變淺，香味減少[8]，T2處理最接近1，且與T1處理差異顯著。綜合來看，T2處理的化學成分最協(xié)調(diào)。

表1 不同處理對雪茄煙常規(guī)化學成分的影響Table 1 Effects of different treatments on the conventional chemical composition of cigar tobacco

2.4 不同處理對雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響

由表2可知，雪茄煙葉的香氣質(zhì)、香氣量、勁頭、濃度、余味、甜度和灰色等指標分值都隨著打頂時間的推遲呈先上升后下降的趨勢，刺激性、雜氣和燃燒性等指標分值逐漸降低，T2處理的總分最高，說明T2處理感官品質(zhì)相對其他處理較好，總體香氣質(zhì)好，香氣量足，燃燒性好，其次是T3處理感官品質(zhì)較好。

表2 不同處理對雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響Table 2 Effects of different treatments on the sensory quality of cigar leaves

3 討論

3.1 打頂方式對煙葉氮代謝酶活性的影響

在煙株的生長過程中，氮代謝的動態(tài)變化對煙葉品質(zhì)影響較大，通過打頂可以調(diào)節(jié)煙株的生長中心，調(diào)整養(yǎng)分供應，調(diào)整煙葉的株高、節(jié)距和留葉數(shù)，進而改變煙田內(nèi)的溫度和光照強度，從而影響煙葉的碳氮代謝強度，影響煙葉內(nèi)部的氮素積累。在煙株的生長前期，氮代謝旺盛有利于為優(yōu)質(zhì)煙葉的形成提供豐厚的物質(zhì)基礎，NR和GS是煙葉氮代謝的關鍵酶，在煙株生長發(fā)育過程中起主要調(diào)節(jié)作用[9]，增強其活性可促進煙株內(nèi)部氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化[10]，也有利于根系對氮素營養(yǎng)的吸收與利用[11]。在本文研究中，NR與GOGAT活性變化趨勢一致，均呈先上升后下降的趨勢，打頂后先上升是由于煙葉在打頂后根系吸收氮素能力增強，氮代謝能力增強，出現(xiàn)下降趨勢是由于煙葉進入成熟衰老期后，整體酶活性減弱，其中T2處理在打頂初期NR和GOGAT活性較低，在打頂后5d時上升到最高，可能是適當延長打頂時間可提高煙葉代謝能力，使煙葉酶活性上升，之后逐漸下降，且酶活性低于其他處理，說明T2處理的煙葉淀粉積累代謝增強，煙葉較其他處理品質(zhì)提高。這與張嘉雯等[12]在植煙密度對雪茄煙葉碳氮代謝的影響上研究一致。GS活性在打頂后呈先下降后上升再下降趨勢，這與曾孝敏[13]在施氮量對烤煙碳氮代謝過程中關鍵酶及代謝產(chǎn)物的影響上研究規(guī)律不同，前期GS活性下降可能與煙葉在打頂后NH4+增多，促使GS將其合成為谷氨酸（Gln），但Gln濃度增加會抑制GS活性。T2處理酶活性一直處于較低水平，說明過早或過晚打頂可使煙株對 NH4+同化能力增強，GS活性增強。

3.2 打頂方式對煙葉生長發(fā)育過程中總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)和煙堿含量的影響

總氮和蛋白質(zhì)是煙葉在生長發(fā)育過程中維持機體生命活力的主要物質(zhì)基礎。在本研究中，煙葉的總氮和蛋白質(zhì)含量呈直線下降趨勢，可能是由于合成的一部分碳水化合物和煙葉內(nèi)部氮素結合使得供給煙株的營養(yǎng)暴增，煙株生長的骨架物質(zhì)充足，因此由于碳水化合物的增加，煙葉含氮化物含量就相對減少[14]。其中T2和T3處理總氮含量相對較低，說明適當推遲打頂可以降低葉片的氮素濃度，對煙葉的成熟有一定促進作用。T2處理蛋白質(zhì)含量一直顯著高于T3處理，說明過晚打頂不利于煙葉內(nèi)部蛋白質(zhì)合成。

游離氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等具有重要意義[15]，在本研究中不同打頂方式下，氨基酸含量變化與氮代謝主要酶NR活性變化趨勢一致，主要因為NR可促進煙株內(nèi)游離氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化，經(jīng)T2處理，煙葉氨基酸含量由剛開始較高水平降低到較低水平，這是由于較晚打頂?shù)臒熤暝跓熖镏械拿芏缺仍绱蝽數(shù)臒熤昝芏刃?，煙株?jié)距增大，因此導致煙葉光合速率增強，光合產(chǎn)物增多。

煙堿經(jīng)煙株根系合成后又重新運輸?shù)饺~片中去。在本研究中，煙葉在打頂處理后，煙堿含量呈緩慢上升趨勢，這可能是由于煙株經(jīng)過打頂后，頂端庫對養(yǎng)分的需求被消除，煙株根系由原來的源變?yōu)閹?，大量光合產(chǎn)物會通過韌皮部傳遞給煙株根系，促進根系的二次生長，大量根系將合成的煙堿輸送給煙葉。這與張丹等[16]在打頂時期對烤煙根系活力及煙堿積累規(guī)律的影響研究一致。其中T3和T2處理煙堿含量一直明顯高于T1處理，T1處理煙堿合成量一直較低，可能是由于打頂后煙株過早吸收土壤中的氮素，轉(zhuǎn)化為供給煙株生長的營養(yǎng)物質(zhì)，導致煙堿在葉片中沒有得到有效積累[17]。

3.3 打頂方式對煙葉調(diào)制后化學成分的影響

不同的打頂方式在影響煙葉氮代謝進程的同時也會影響煙葉中的化學成分[12]。調(diào)制后煙葉的糖含量對雪茄煙的香吃味具有重要影響，糖堿比較適宜，煙氣醇和，有利于提高煙葉的內(nèi)在品質(zhì)[18]。綜合分析印尼和中國海南等地的煙葉化學成分含量可知，優(yōu)質(zhì)雪茄煙中部葉的總糖含量約 2%、總氮含量4%～6%、煙堿含量1%～2%、鉀含量≥2%、鉀氯比≥4[19]。煙葉中淀粉含量過高會導致煙葉燃燒產(chǎn)生雜氣，使抽吸時香吃味變差。蛋白質(zhì)含量較高時，煙氣強度較大，香吃味變差，具有刺激性及辛辣味。煙葉的鉀氯比維持在≥4、氮堿比維持在1左右的條件下煙葉品質(zhì)較好[8]。本試驗研究表明，T1處理總糖和還原糖含量最高，但明顯低于優(yōu)質(zhì)煙葉糖含量，這主要因為晾制時間過長，在晾制過程中糖經(jīng)過煙葉的呼吸作用被消耗[18]，T2處理煙堿含量較T1和T3處理高，這與伍發(fā)明等[20]在打頂期對湖北恩施煙區(qū)雪茄煙品種產(chǎn)質(zhì)量的影響研究結果不一致，可能是因為在煙株經(jīng)T1處理前期，當?shù)赜晁^多，導致煙株莖葉生長旺盛，煙葉細胞間隙較大，組織疏松，使調(diào)制后煙堿含量相對較低。T2處理的鉀氯比最高，說明煙葉的燃燒性最好；氮堿比最接近1，說明煙葉的香味較多，刺激性較小，吃味醇和，這與董維杰等[21]的研究結果一致。

3.4 打頂方式對調(diào)制后煙葉感官質(zhì)量的影響

煙葉的感官質(zhì)量是評價優(yōu)質(zhì)雪茄煙的關鍵因素，本研究中不同處理煙葉的香氣質(zhì)、香氣量、勁頭、濃度、余味、甜度和灰色等指標分值都隨著打頂時間的推遲呈先上升后下降的趨勢，可能是現(xiàn)蕾期打頂煙株營養(yǎng)供應充足，葉片發(fā)育較大，較初花期和盛花期打頂煙田內(nèi)密度較大，煙葉呼吸作用減慢，感官質(zhì)量下降。

4 結論

不同打頂方式對雪茄煙葉氮代謝關鍵酶活性、煙堿、氨基酸及相關化學成分含量都有顯著影響，初花期打頂?shù)臒熑~氮代謝酶活性由剛開始較高到煙葉成熟后期下降到最低，說明煙葉在成熟后期氮代謝穩(wěn)定向碳代謝轉(zhuǎn)化，煙堿含量在打頂后逐漸上升，初花期和盛花期打頂煙堿積累量較多，同時初花期打頂?shù)臒熑~在晾制后的化學成分也較其他處理協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量評價較好，因此雪茄煙在四川省什邡市種植時應以初花期打頂為宜，盛花期次之。