張 昕，張 銘，何宏軒，胡延春，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130； 2.中國科學院 動物研究所，北京 100101)

近年來，動物源性的流感病毒不斷突破物種屏障感染人類，成為威脅人類健康的重要因素之一。H9N2亞型AIV病毒最早于1966年從北美火雞體內分離，我國廣東省于1994年首次分離鑒定得到該毒株，并在家禽中建立了穩(wěn)定的種系。近年來研究表明，由于H9N2持續(xù)在家禽中廣泛暴發(fā)流行并變異，增加了與其他亞型流感病毒重組的機會，擴大了宿主范圍，使其具備了感染哺乳動物的能力，且能夠不通過其他宿主而直接感染人類。H9N2亞型流感病毒是引起禽類發(fā)病的主要亞型之一。禽流感主要侵害動物的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等，可從無癥狀或溫和癥狀到高度致死性的感染。雖然H9N2屬于低致病性禽流感，但可引起免疫抑制以及后續(xù)繼發(fā)感染，如雞群的產(chǎn)蛋率下降、生長緩慢甚至低死亡率，對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于其能直接感染人類，所以極有可能成為下一個流感暴發(fā)的候選毒株之一。

由于大多數(shù)天然多酚類化合物具有很強的抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調節(jié)等特性，其在防治炎癥性疾病方面發(fā)揮著重要的作用，特別是其中幾種不同的咖啡酸奎寧酸，如綠原酸(3-caffeoylquinic acid， 3-CQA)、隱綠原酸(4-O-caffeoylquinic acid， 4-CQA)、新綠原酸(5-caffeoylquinic acid， 5-CQA)。以往的藥理研究表明，綠原酸具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調節(jié)、抗菌的作用，而4-CQA是綠原酸的異構體，在炎癥性疾病中的效應作用以及機制尚未明確。因此，本試驗采用4-CQA干預被H9N2-AIV感染的小鼠，初步探討4-CQA對機體免疫調節(jié)和抗氧化作用，為隱綠原酸作為病毒性肺損傷疾病的潛在治療藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株

本試驗中所用禽流感病毒是A/sparrow/Shanghai/09/2013(H9N2)株，紅細胞凝集價(HA)為2，雞胚半數(shù)致死量(EID)為10/0.1 mL，由本實驗室經(jīng)SPF雞胚傳代擴增并保存。

1.1.2 試驗動物

90只6～8周齡SPF級昆明系小鼠(體重10～15 g)，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。小鼠自由采食、飲水、自然光照、室溫飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

隱綠原酸(純度≥98.6%)購自成都德思特生物技術有限公司，小鼠抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體購自BD Pharmingen，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、髓過氧化物酶(MPO)測試盒均購自南京建成生物工程研究所，改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組

將健康的SPF級昆明系小鼠隨機分成H9N2組、H9N2+4-CQA組、空白對照組、4-CQA組四組。分別為H9N2亞型禽流感病毒模型組18只，H9N2亞型禽流感病毒滴鼻后灌胃4-CQA混懸液制劑組36只，健康小鼠空白對照組18只，4-CQA混懸液制劑灌胃對照組18只。

1.2.2 4-CQA混懸液的制備

將100 mg隱綠原酸用RPMI1640培養(yǎng)基定容到10 mL，配制成10 mg·mL的混懸液，充分混勻后用于小鼠的灌胃。

1.2.3 小鼠的處理

將4組小鼠在同等隔離條件下飼養(yǎng)3 d適應環(huán)境。于第4天對H9N2組、H9N2+4-CQA組兩組小鼠進行H9N2亞型禽流感病毒尿囊液(1×10EID)滴鼻攻毒，每只50 μL；空白對照組、4-CQA組兩組滴鼻等量無菌尿囊液。于攻毒2 h后對H9N2+4-CQA組、4-CQA組兩組進行隱綠原酸混懸液制劑的灌胃(100 mg·kg)；H9N2組、空白對照組兩組灌胃等量的PBS溶液，連續(xù)7 d。于灌胃開始后第3、5、7天對H9N2組、空白對照組、4-CQA組3組每組每次隨機抽取6只小鼠進行采樣，H9N2+4-CQA組每次隨機抽取12只小鼠進行采樣。

1.2.4 樣品采集及處理

實驗結束后，每組隨機挑選出的小鼠在無菌環(huán)境下進行眼球摘除采血。采血后斷頸處死，并迅速分離出肺、脾，小鼠左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定1周后進行病理切片檢測，右肺迅速放入液氮中快速冷卻后存放于-80 ℃冰箱中以備后續(xù)使用，脾浸泡于4 ℃ PBS中用于細胞流式檢測。

1.2.5 臟器指數(shù)測定

無菌條件剖解小鼠后，立即取肺和脾放入0.9% NaCl溶液中清洗，用吸水紙吸干表面水分，分析天平稱重。按以下公式計算肺指數(shù)和脾指數(shù)：肺指數(shù)(%)=(肺重/小鼠體重)×100；脾指數(shù)(%)=(脾重/小鼠體重)×100。

1.2.6 小鼠肺組織病理切片

取小鼠肺用4%的多聚甲醛固定24 h，修整、清洗、常規(guī)脫水、浸蠟經(jīng)石蠟包埋切成5 μm厚的薄片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.2.7 小鼠脾T淋巴細胞亞群測定

將脾按常規(guī)方法制備10mL脾細胞懸液，采用小鼠抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體，按照說明避光染色，用流式細胞儀檢測小鼠脾T淋巴細胞亞群數(shù)量及比率。

1.2.8 肺T-SOD活性、MDA含量、MPO活性測定

將肺照說明書制備成10%組織勻漿，儲備于-20 ℃。小鼠肺T-SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，MPO活性測定采用酶比色法，嚴格按照試劑盒說明步驟進行檢測。蛋白含量用考馬斯亮藍染色法測定，嚴格按照試劑盒步驟進行，根據(jù)公式算出T-SOD活性、MDA含量和MPO活性。

1.3 試驗數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，通過單因素ANOVA進行分析，結果以“平均值±方差”表示。采用Tukey進行<0.05水平的顯著性分析，主成分分析用于分析處理間差異和主要貢獻因子。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀和剖檢變化

H9N2組小鼠大多數(shù)在攻毒第3天的時候開始出現(xiàn)不同程度的感染癥狀，如精神沉郁、食欲下降、活動量減少、呼吸急促并伴隨腹式呼吸、被毛雜亂無光澤等；H9N2+4CQA組在第3天左右也出現(xiàn)與H9N2組相似癥狀，但程度較輕并逐漸好轉，在第7天時，與空白對照組無明顯差異；空白對照組小鼠健康、活動量正常、被毛光澤無明顯臨床癥狀出現(xiàn)；4-CQA組與空白對照組表現(xiàn)相似，無明顯癥狀出現(xiàn)。剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)，H9N2組小鼠肺呈暗紅色，有淤血和針尖狀出血現(xiàn)象；H9N2+4-CQA組小鼠肺外觀也呈暗紅色，但較H9N2組顏色較淡，淤血和出血狀況也較輕甚至無明顯病理癥狀；空白對照組和4-CQA組小鼠肺外觀呈粉紅色，無明顯組織病理學癥狀。

2.2 臟器指數(shù)變化

H9N2組小鼠感染H9N2亞型AIV后引發(fā)肺部炎癥，造成肺質量增加，肺指數(shù)上升；免疫器官脾萎縮，脾質量下降，脾指數(shù)下降。4-CQA干預后，H9N2+4-CQA組肺質量下降減緩，與H9N2組比較數(shù)值上在第3天時肺指數(shù)無顯著性差異，在第5天呈顯著性差異，明顯降低肺指數(shù)；脾質量下降減緩，數(shù)值上第3天時脾指數(shù)無顯著性差異，第5天和第7天呈顯著性差異，明顯升高脾指數(shù)；與空白對照組比較，數(shù)值上在第3～7天時肺指數(shù)呈顯著性差異，第3天和第7天時脾指數(shù)無顯著性差異，第5天時脾指數(shù)呈顯著性差異。4-CQA組與空白對照組的肺指數(shù)和脾指數(shù)數(shù)值相近無統(tǒng)計學差異，結果見表1。

2.3 肺組織病理變化

H9N2組小鼠感染H9N2亞型AIV后，肺主要出現(xiàn)肺間質增生，偶見漏出性出血，肺泡腔內大量紅細胞出現(xiàn)，大量中性粒細胞、淋巴細胞等浸潤，嚴重時甚至出現(xiàn)膿腫灶、肺泡壁毛細血管擴張充血或淤血等組織病理學現(xiàn)象(圖1A-C)；灌胃4-CQA干預后，H9N2+4CQA組小鼠臟肺毛細血管擴張充血或淤血，肺泡隔輕度增生變寬，偶見少量炎性細胞浸潤(圖1-D-E)，總體肺損傷程度明顯輕于H9N2組；空白對照組(圖1-G-H)和4-CQA對照組小鼠肺(圖1-I-J)未見明顯組織病理學變化，結果見圖1。

表1 小鼠臟器指數(shù)

2.4 脾T淋巴細胞亞群變化

CD4、CD8T淋巴細胞亞群組成了復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)對免疫應答進行精細調節(jié)，CD4/CD8比值是機體免疫功能網(wǎng)絡調控的重要樞紐，調控免疫進行的方向。H9N2組小鼠感染H9N2亞型AIV后脾CD4T淋巴細胞百分比下降，CD8T淋巴細胞百分比上升，但數(shù)據(jù)上無統(tǒng)計學差異，CD4/CD8比值下降，數(shù)值上與空白對照組呈顯著性差異(<0.05)。隱綠原酸干預后，CD4T淋巴細胞百分比上升，CD8T淋巴細胞百分比下降，數(shù)值上與空白對照組和H9N2組均無統(tǒng)計學差異；CD4/CD8比值上升，數(shù)值上與空白對照組無統(tǒng)計學差異，與H9N2組呈顯著性差異。4-CQA組CD4T淋巴細胞百分比下降、CD8T淋巴細胞百分比下降但數(shù)值上與空白對照組無統(tǒng)計學差異，CD4/CD8比值與CON組相近無統(tǒng)計學差異，結果見表2。表明隱綠原酸能起到調節(jié)T細胞亞群，維持免疫平衡，提高免疫力的作用。

2.5 肺勻漿T-SOD活性變化

圖1 小鼠肺組織病理學切片(A-J，200×)Fig.1 Pathological changes of lung(A-J，200×)

H9N2組小鼠感染H9N2亞型AIV后肺的T-SOD活性逐漸降低，第5～7天數(shù)值上與空白對照組呈顯著性差異(<0.05)。隱綠原酸干預后，肺的T-SOD活性降低減緩，在第5天數(shù)值上與H9N2組無顯著性差異，與空白對照組呈顯著性差異(<0.05)，第7天數(shù)值上與H9N2組和空白對照組均無顯著性差異。4-CQA組肺的T-SOD活性與空白對照組相近無統(tǒng)計學差異，結果見圖2。

2.6 肺勻漿MDA含量變化

H9N2組小鼠感染H9N2亞型AIV后肺的MDA含量升高，第5～7天數(shù)值上與空白對照組呈顯著性差異(<0.05)。隱綠原酸干預后，小鼠肺的MDA含量上升減緩，第5天數(shù)值上與H9N2組和空白對照組都呈顯著性差異(<0.05)，第7天數(shù)值上與H9N2組呈顯著性差異，與空白對照組無統(tǒng)計學差異。4-CQA組小鼠肺的MDA含量與空白對照組相近無統(tǒng)計學差異，結果見圖3。

表2 第7天各組小鼠脾T淋巴細胞亞群百分比及比值

*，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)；#，與攻毒組比較差異顯著(P<0.05)。下同。* showed the significant difference compared with that of control (P<0.05)；# showed the significant difference compared with that of H9N2 group (P<0.05). The same as below.圖2 小鼠肺T-SOD活性變化Fig.2 Activity of T-SOD in lung of mice

2.7 肺勻漿MPO活性變化

H9N2組小鼠感染H9N2亞型AIV后肺的MPO活性上升，第5～7天數(shù)值上與空白對照組呈顯著性差異(<0.05)。隱綠原酸干預后，小鼠肺的MPO活性上升減緩，第5 天數(shù)值上與空白對照組呈顯著性差異(<0.05)，與H9N2組無統(tǒng)計學差異；第7天與空白對照組無統(tǒng)計學差異，與H9N2組呈顯著性差異(<0.05)。4-CQA組小鼠肺的MPO活性與空白對照組相近無統(tǒng)計學差異，結果見圖4。

圖3 小鼠肺MDA含量變化Fig.3 Content of MDA in lung of mice

圖4 小鼠肺MPO活性變化Fig.4 Activity of MPO in the lung of mice

3 討論

酚酸是一類重要的植物多酚類化合物，它們存在于各種植物性食品中，如蔬菜葉、果實和種子，尤其是果皮含量濃度較高。目前，綠原酸是最常見和豐富的酚酸類物質，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、保肝等藥理活性。而隱綠原酸是綠原酸的一種特殊異構體，具有相似的結構特征，但隱綠原酸具有的藥理活性目前報道較少。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，惡性入侵有害微毒植物紫莖澤蘭中能分離純化得出隱綠原酸，不僅能用于生物防除，還能用于紫莖澤蘭的潛在藥物開發(fā)利用。

流感病毒介導肺損傷的免疫病理機制復雜，病毒進入肺部感染肺部支氣管黏膜和肺泡壁上皮細胞，促使機體發(fā)生免疫反應，造成不受控制的肺過度炎癥、全身炎癥或活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。因此流感危重患者死亡的主要原因，并非是不受控制的病毒復制造成的細胞損傷，而是免疫病理損傷。有研究表明，過度的免疫應答是造成機體病理損傷的主要原因之一。T淋巴細胞是免疫細胞中一類非常重要的細胞，在機體的細胞免疫中起重要的作用，成熟的T淋巴細胞按CD表型不同可分為CD4T淋巴細胞和CD8T淋巴細胞，其亞群之間的不平衡可以造成機體免疫紊亂。CD4/CD8也是評判機體免疫平衡狀態(tài)的重要參數(shù)之一，同時對疾病的嚴重程度和預后具有重要意義，當 CD4/CD8比值偏離時表明細胞免疫功能紊亂。H9N2+4-CQA組中CD4T淋巴細胞百分比和CD4/CD8T淋巴細胞比值與H9N2組比較均顯著升高，表明灌胃4-CQA混懸液能起到調節(jié)T細胞亞群，維持免疫平衡，提高免疫力的作用。

綜上，隱綠原酸能有效的提高由H9N2-AIV病毒感染引起的小鼠脾T淋巴細胞亞群CD4/CD8的比值，減輕小鼠肺炎性細胞浸潤、肺間質增寬和出血，降低肺的氧化應激水平，從而達到保護小鼠、緩解肺損傷程度的目的。本試驗為進一步發(fā)掘4-CQA的藥理藥效作用的研究提供新的理論依據(jù)，同時也為新的藥物研發(fā)提供了新的參考依據(jù)。