于大永， 付思雨， 溫澤宇， 宋 佳， 史麗穎

(大連大學(xué)生命健康學(xué)院， 大連 116622)

癌癥已經(jīng)成為危害人類健康的最大因素之一[1]，也是我國居民首要死因。據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示：全球新增癌癥病例1 810萬人，死亡960萬人[2]。目前針對(duì)癌癥靶蛋白設(shè)計(jì)的藥物分子樣式繁多，對(duì)應(yīng)治療的靶點(diǎn)也多種多樣。以保守性較高的癌癥靶點(diǎn)為基礎(chǔ)開發(fā)的抗癌藥物是目前臨床用藥的主流，針對(duì)較高保守性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性藥物具有一定的挑戰(zhàn)。另外，在抗藥性方面，保守的構(gòu)效關(guān)系不利于針對(duì)耐藥性設(shè)計(jì)藥物[3]。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，常伴有還原性谷胱甘肽(GSH)水平降低及谷胱甘肽過氧化物酶4(phospholipid glutathione peroxidase 4,GPX4)的下調(diào)[4-5]。細(xì)胞外液的Fe3+通過轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)并被還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與細(xì)胞內(nèi)過量的H2O2通過芬頓反應(yīng)生成大量的脂質(zhì)活性氧(ROS)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物(LPO)的生成[6-8]。GPX4具有清除脂質(zhì)過氧化物的功能，失活GPX4將導(dǎo)致氧化平衡被打破、脂質(zhì)過氧化物破壞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活鐵死亡[9]。目前已發(fā)現(xiàn)許多鐵死亡激動(dòng)劑，比如erastin、雙氫青蒿素和青蒿琥酯等，可通過人為干預(yù)激活鐵死亡，為鐵死亡相關(guān)疾病治療提供新思路[6,10]。

目前許多具有抗腫瘤活性的中藥單體化合物被發(fā)現(xiàn)，例如姜黃素、芹菜素、青蒿素(artemisinin，ARS)等[11-13]。其中，ARS包含一個(gè)內(nèi)過氧化物橋的結(jié)構(gòu)，與亞鐵離子反應(yīng)生成自由基，繼而對(duì)細(xì)胞造成損傷[14]。而鐵死亡途徑正常激活的關(guān)鍵因素也是鐵，這提示ARS、鐵死亡及腫瘤三者之間存在密切聯(lián)系[15]。

本研究根據(jù)青蒿活性小分子藥理學(xué)性質(zhì)及GPX4的活性口袋結(jié)構(gòu)特征對(duì)青蒿活性小分子進(jìn)行類藥性篩選、GPX4-配體對(duì)接模擬、互作模式對(duì)比分析、自由結(jié)合能計(jì)算和分子動(dòng)力學(xué)模擬，篩選出GPX4潛在激動(dòng)劑，以期為開發(fā)特異性高、效力強(qiáng)的GPX4激動(dòng)劑提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 配體分子準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)所用的配體在ChemBioDraw Ultra 14.0軟件中繪制，經(jīng)過Schr?dinger軟件中的“LigPrep”模塊處理，再使用OPLS3力場優(yōu)化。對(duì)于配體結(jié)構(gòu)，不考慮互變異構(gòu)體，每個(gè)配體只產(chǎn)生一個(gè)立體異構(gòu)體，其余參數(shù)被設(shè)置成默認(rèn)參數(shù)。

1.2 類藥性篩選

本實(shí)驗(yàn)采用Lipinski規(guī)則與Veber規(guī)則，在“中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)”(https:∥tcmspw.com)上對(duì)青蒿活性小分子進(jìn)行類藥性篩選，可大幅度降低篩選范圍和研發(fā)成本。Lipinski規(guī)則包括相對(duì)分子量不大于500、氫鍵供體不超過5個(gè)、氫鍵受體不超過10個(gè)、可旋轉(zhuǎn)鍵不超過10個(gè)和脂水分配系數(shù)不超過5。Veber規(guī)則包括可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵不超過10個(gè)、極性表面積不超過1.4 nm2和氫鍵總數(shù)不超過12個(gè)。

1.3 GPX4結(jié)構(gòu)預(yù)處理

GPX4蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB:2OBI)來源于PDB數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org)，具有183個(gè)氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)分辨率為0.155 nm。利用Schr?dinger軟件刪去GPX4蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，在“Protein preparation wozard”模塊中，對(duì)GPX4進(jìn)行加氫以及對(duì)非完整氨基酸進(jìn)行矯正。同時(shí)，在pH=7.0±0.2下實(shí)現(xiàn)質(zhì)子化殘基的氫鍵優(yōu)化。最后，在OPLS3力場下使GPX4蛋白晶體結(jié)構(gòu)能量最小化。

1.4 GPX4活性口袋分析

LI等[16]預(yù)測了GPX4活性及關(guān)鍵氨基酸，發(fā)現(xiàn)GPX4的關(guān)鍵氨基酸由ASP21、ASP23、LYS31、VAL98、PHE100、ASP101和MET102氨基酸殘基組成。本實(shí)驗(yàn)選取這7個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基0.3 nm范圍內(nèi)的氨基酸殘基為活性口袋，用SiteMap程序?qū)PX4活性口袋進(jìn)行特征分析。

1.5 GPX4-配體對(duì)接實(shí)驗(yàn)

LI等[16]發(fā)現(xiàn)的化合物1d4(PKUMDL-LC-101-D03)可作為GPX4的強(qiáng)效激動(dòng)劑。本實(shí)驗(yàn)以1d4與GPX4對(duì)接分?jǐn)?shù)(Docking Score=-5.140 kcal/mol)為陽性對(duì)照，利用Schr?dinger軟件中的“Glide”模塊進(jìn)行GPX4-配體對(duì)接實(shí)驗(yàn)。其中，“Glide”中的SP對(duì)接用于GPX4-配體對(duì)接篩選、XP對(duì)接用于與陽性對(duì)照物1d4進(jìn)行GPX4-配體互作模式對(duì)比分析。GPX4-配體對(duì)接實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地考察GPX4與配體的整體結(jié)合效果，能夠彌補(bǔ)類藥性篩選的缺陷。

1.6 GPX4-配體結(jié)合自由能計(jì)算

本實(shí)驗(yàn)首先使用Schr?dinger軟件中的Prime MM-GBSA功能計(jì)算GPX4與配體的結(jié)合自由能，選擇溶劑模型為VSGB，采用系統(tǒng)地對(duì)配體以及GPX4氨基酸位置、方向和構(gòu)象采樣的方式(Hierarchical Sampling)。在計(jì)算復(fù)合物體系自由結(jié)合能時(shí)，設(shè)置配體周圍0.3 nm范圍內(nèi)的氨基酸為柔性狀態(tài)。將GPX4晶體結(jié)構(gòu)在Schr?dinger軟件中進(jìn)行能量最小化處理，在OPLS_2005力場下，逐一地對(duì)GPX4-配體計(jì)算結(jié)合自由能并分析比較。

1.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用Schr?dinger軟件中的“Desmond”模塊對(duì)GPX4-配體復(fù)合物進(jìn)行時(shí)長為50 ns的動(dòng)力學(xué)模擬。系統(tǒng)地采用SPC溶劑模式，通過在1 nm×1 nm×1 nm的正方形盒中加入適當(dāng)數(shù)量的反離子進(jìn)行中和，從而在GPX4和盒邊之間形成緩沖區(qū)，選取力場為OPLS_2005。本實(shí)驗(yàn)首先在常溫常壓的系綜(NPT)下進(jìn)行時(shí)長為10 ns的動(dòng)力學(xué)模擬，對(duì)體系進(jìn)行優(yōu)化。隨后在300 K的溫度和101.325 kPa的壓力下，對(duì)復(fù)合物進(jìn)行時(shí)長為50 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，在每1.2 ps和每100 ps下分別記錄能量和軌跡原子坐標(biāo)數(shù)據(jù)。模擬過程中對(duì)復(fù)合物體系均方根偏差(RMSD)以及GPX4-配體相互作用氨基酸進(jìn)行監(jiān)控，考察復(fù)合物體系的穩(wěn)定狀態(tài)以及氨基酸作用效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 類藥性篩選

從TCMSP中檢索得到126個(gè)青蒿活性小分子，根據(jù)Lipinski規(guī)則和Veber規(guī)則進(jìn)行類藥性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50個(gè)青蒿活性小分子符合要求，可以進(jìn)行后續(xù)研究，從而大幅度縮小篩選范圍和降低研發(fā)成本。

2.2 GPX4活性口袋分析

本實(shí)驗(yàn)采用SiteMap程序?qū)PX4活性口袋進(jìn)行了特征分析。GPX4活性口袋形狀類似梭形(圖1)，周圍分布著7個(gè)關(guān)鍵氨基酸，其中大部分為帶電極性氨基酸，如ASP21、ASP23、LYS31、ASP101和MET102。帶電極性氨基酸易與配體形成氫鍵作用，也會(huì)使GPX4與配體間形成靜電作用，從而增加結(jié)合效果。

圖1 GPX4的活性口袋圖Figure 1 The active SiteMap of GPX4

GPX4活性口袋存在多處的氫鍵受體、氫鍵供體和疏水結(jié)構(gòu)(圖2)，大部分由loop環(huán)組成，另外還有小部分α-螺旋結(jié)構(gòu)，由此可見該活性口袋結(jié)構(gòu)構(gòu)象較為靈活。

圖2 GPX4的SiteMap分析Figure 2 The SiteMap analysis of GPX4注：圖中連貫條狀為GPX4二級(jí)結(jié)構(gòu)，而無規(guī)則曲面為其活性口袋，其中紅色區(qū)域代表氫鍵受體結(jié)構(gòu)，紫色區(qū)域代表氫鍵供體結(jié)構(gòu)，黃色區(qū)域?yàn)槭杷Y(jié)構(gòu)。

2.3 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

有文獻(xiàn)[16]報(bào)道1d4可作為GPX4的激動(dòng)劑。前期類藥性實(shí)驗(yàn)中篩選得到的50個(gè)青蒿活性小分子經(jīng)過Schr?dinger軟件的“Glide”模塊中的SP對(duì)接后，發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)青蒿活性小分子的對(duì)接分?jǐn)?shù)(Docking score)高于陽性對(duì)照物1d4的(表1)。7個(gè)青蒿活性小分子和1d4都與GPX4活性口袋的氨基酸存在較多的范德華力作用，并都具有氫鍵作用。1d4的作用方式與報(bào)道[16]相似，與關(guān)鍵氨基酸Asp21及Asp23存在相互作用(氫鍵和鹽橋)，2種氨基酸在報(bào)道中被認(rèn)為是產(chǎn)生活性的重要因素。與其他青蒿活性小分子相比，patuletin和kaempferol 形成較多的氫鍵作用，可以發(fā)現(xiàn)兩者均與ASP21和ASP23存在氫鍵作用，這與1d4類似。除了與2個(gè)關(guān)鍵氨基酸作用外，1d4、patuletin、kaempferol均與LYS31存在氫鍵作用。

盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿中代表成分ARS的對(duì)接分?jǐn)?shù)略低于陽性對(duì)照物1d4的(表1)，但是ARS與GPX4活性口袋存在經(jīng)典氫鍵、碳?xì)滏I、范德華力及疏水作用，和陽性對(duì)照物1d4與GPX4的互作模式相似，因此，需要進(jìn)一步研究ARS與GPX4的作用方式。本實(shí)驗(yàn)將篩選得到的8個(gè)青蒿活性小分子采用“Glide”模塊中的XP依次對(duì)接于GPX4活性口袋，并和GPX4與1d4的互作模式進(jìn)行比較(表1)。利用Pymol軟件及Insight Ⅱ軟件中的“Receptor-Ligand Interactions”模塊，分析1d4、patuletin、kaempferol、ARS與GPX4之間的作用方式。

表1 配體在GPX4活性口袋內(nèi)的作用方式Table 1 The mode of action of the ligand in the active pocket of GPX4

由結(jié)果(圖3)可知：(1)陽性對(duì)照物1d4在活性口袋中呈“J”型構(gòu)象。1d4與LYS31、PHE100、ASP21、ASP23均形成氫鍵作用，同時(shí)1d4與ASP21、ASP23形成鹽橋作用。對(duì)接結(jié)果顯示1d4構(gòu)象與對(duì)接口袋的形狀較為契合，因此與口袋周圍氨基酸產(chǎn)生廣泛的范德華作用力。(2)patuletin與kaempferol在活性口袋中都呈“V”型構(gòu)象。patuletin和kaempferol均與關(guān)鍵氨基酸ASP21、ASP23形成氫鍵作用，并具有相似的范德華作用方式。除此之外，patuletin與LYS31、VAL98、ASP101形成經(jīng)典氫鍵作用，kaempferol與LYS90形成經(jīng)典的氫鍵作用。(3)ARS在活性口袋中呈“T”型構(gòu)象。ARS與MET102形成經(jīng)典氫鍵作用，與 LYS90、PHE100形成碳?xì)滏I作用，與ASP21、ILE22、ALA93、LYS99、ASP101形成范德華力作用，與ALA94、VAL98形成疏水作用。

圖3 陽性對(duì)照物1d4、patuletin、kaempferol、ARS在活性口袋的作用方式Figure 3 The mode of action of the positive control 1d4, patuletin, kaempferol and ARS in the active pocket of GPX4

綜上，對(duì)接模擬結(jié)果顯示8個(gè)青蒿活性小分子與GPX4都有經(jīng)典氫鍵和范德華力作用，其中，patuletin、kaempferol和1d4均與關(guān)鍵氨基酸ASP21、ASP23形成氫鍵，可能與陽性對(duì)照物具有相同的活性潛力。

2.4 GPX4-配體復(fù)合物結(jié)合自由能計(jì)算

為排除分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性可能，判斷8個(gè)青蒿活性小分子在GPX4復(fù)合物體系的穩(wěn)定性。由復(fù)合物體系結(jié)合自由能的計(jì)算結(jié)果(表2)可知：(1)陽性對(duì)照物1d4在GPX4蛋白復(fù)合物體系的結(jié)合自由能(ΔGbind)為-42.699 kcal/mol。其中范德華力(ΔGbindvdW=-36.868 kcal/mol)與庫侖力(ΔGbindCoulomb=-17.917 kcal/mol)起主導(dǎo)作用，疏水作用(ΔGbindLipo=-9.142 kcal/mol)也作為關(guān)鍵作用力維持著體系的穩(wěn)定。(2)8個(gè)化合物的結(jié)合自由能與1d4類似，范德華力、庫侖力和疏水作用為關(guān)鍵作用力。其中patuletin和kaempferol的氫鍵結(jié)合能(ΔGbindHbond)對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)高于其他8個(gè)化合物，這符合對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)顯示patuletin、kaempferol均與1d4有著相似的作用方式。(3)作為青蒿中的代表成分ARS的結(jié)合自由能達(dá)到-34.738 kcal/mol，這與patuletin和kaempferol的結(jié)合自由能(分別為-38.865 kcal/mol和-36.055 kcal/mol)數(shù)值相近(表2)，且高于其他青蒿活性小分子。

表2 配體在GPX4復(fù)合物體系的結(jié)合自由能Table 2 The MM-GBSA free energy of ligands bound to GPX4 kcal/mol

綜上，ARS、patuletin、kaempferol的作用方式與陽性對(duì)照物1d4的類似，且優(yōu)于其他化合物，可作為GPX4先導(dǎo)激動(dòng)劑進(jìn)一步研究。

2.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

為進(jìn)一步了解GPX4-配體的作用情況，分別將陽性對(duì)照物1d4、artemisinin(ARS)、patuletin、kaempferol與GPX4形成的4種復(fù)合物體系置于模擬的溶液環(huán)境中，并進(jìn)行時(shí)長為50 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。對(duì)模擬過程中化合物在活性口袋中的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，由結(jié)果(圖4)可知：(1)4種化合物在整個(gè)模擬過程中的運(yùn)動(dòng)幅度不大，對(duì)接口袋位置變化相對(duì)于初始位置的RMSD(均方根偏差)均不超過0.2 nm，這表明4種化合物均可在模擬過程中穩(wěn)定地結(jié)合于對(duì)接口袋，相關(guān)作用方式較為持續(xù)。(2)RMSD數(shù)值顯示：在整個(gè)模擬過程中，ARS和kaempferol在對(duì)接口袋位置的變化幅度最小，其次是patuletin；陽性對(duì)照物1d4的運(yùn)動(dòng)幅度比以上3種青蒿活性小分子的明顯。

圖4 配體在對(duì)接口袋的穩(wěn)定性分析Figure 4 The stability analysis of ligands in the docking pocket

隨后，通過對(duì)模擬過程中的作用方式進(jìn)行監(jiān)控，對(duì)比分析候選化合物與關(guān)鍵氨基酸間是否存在持續(xù)且強(qiáng)力的作用方式。由動(dòng)力學(xué)模擬過程中氨基酸作用分析結(jié)果(圖5)可知：(1)陽性對(duì)照物1d4與關(guān)鍵氨基酸ASP21、ASP23間主要存在氫鍵、水橋以及離子鍵的相互作用，其中以氫鍵為主要作用方式。模擬過程中與氨基酸VAL98、PHE100間的氫鍵作用對(duì)穩(wěn)定結(jié)合于口袋中同樣具有較突出的貢獻(xiàn)。(2)相比于1d4，patuletin、kaempferol與關(guān)鍵氨基酸ASP21、ASP23間的作用效果均更強(qiáng)烈。patuletin與關(guān)鍵氨基酸間的主要作用方式包括水橋作用和氫鍵作用，且以水橋作用為主導(dǎo)，而與LYS90、VAL98間的氫鍵作用也有突出貢獻(xiàn)。kaempferol與關(guān)鍵氨基酸間的相互作用包含氫鍵、水橋和離子鍵的相互作用，這與陽性對(duì)照物1d4相似。相對(duì)于patuletin和1d4，kaempferol與關(guān)鍵氨基酸間的離子相互作用和氫鍵作用是最強(qiáng)的，這符合RMSD數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，較強(qiáng)的作用方式使得kaempferol更穩(wěn)定地結(jié)合于對(duì)接口袋。除此之外，與patuletin和1d4相同，kaempferol與VAL98間也存在較強(qiáng)的氫鍵作用。(3)青蒿代表藥物ARS與關(guān)鍵氨基酸間的作用方式對(duì)于整個(gè)結(jié)合過程的貢獻(xiàn)值很微小，主要貢獻(xiàn)方式為與MET102間的強(qiáng)氫鍵作用。通過對(duì)模擬過程中候選化合物與蛋白間的作用方式分析可知：kaempferol、patuletin均與關(guān)鍵氨基酸存在較強(qiáng)的相互作用且強(qiáng)于與陽性對(duì)照物1d4的，與VAL98形成較強(qiáng)的氫鍵作用是ARS、kaempferol和patuletin共有的特征。以上結(jié)果與分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。

圖5 分子動(dòng)力模擬蛋白-配體作用方式Figure 5 The molecular dynamics simulating protein-ligand interaction注：作用方式持續(xù)時(shí)間占比=作用方式持續(xù)時(shí)間/50 ns。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于GPX4活性口袋結(jié)構(gòu)特征及藥理學(xué)性質(zhì)，對(duì)在“中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)”上檢索得到的126個(gè)青蒿活性小分子進(jìn)行虛擬篩選，通過類藥性篩選、GPX4-配體對(duì)接模擬篩選、GPX4-配體互作模式分析、GPX4-配體結(jié)合自由能計(jì)算以及分子動(dòng)力學(xué)模擬，篩選出成藥優(yōu)良、抑制效力強(qiáng)的青蒿活性小分子。研究結(jié)果表明artemisinin(ARS)、patuletin和kaempferol具有潛在的抑制鐵死亡活性，可作為GPX4先導(dǎo)激動(dòng)劑進(jìn)行研究。