田 璞，張世芹，吳新文

（貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽 550014）

不確定度是指實驗過程中由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度。本文依據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[1]對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測定》（GB 5009.86—2016）[2]中各因素進(jìn)行評估，依據(jù)樣品的檢測結(jié)果，結(jié)合所用儀器等不確定度進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湯臣倍健葡萄籽維生素C加E片；L(+)-抗壞血酸（維生素C）：純度99.76%，Dr.Ehrenstorfer；偏磷酸、磷酸三納，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；L- 半胱氨酸溶液、磷酸，優(yōu)級純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、十六烷基三甲基溴化銨，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260液相色譜儀（配有1個四元泵、1個二元泵、1個兩位六通閥、1個三通接頭、1個紫外檢測器、1個熒光檢測器、自動進(jìn)樣器和柱溫箱），美國Agilent公司；TG16W高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；ME204天平，美國梅特勒-托利多公司；Mil-lQ 型超純水儀，德國Merck公司；vortex-genie2渦旋混合器，美國Scientif-ic Industries公司；S220型pH計，精度±0.01，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

L(+)-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.001 g·mL-1）的配制：準(zhǔn)確稱取L(+)-抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01 g，用濃度為20 g·L-1的偏磷酸定容至10 mL。儲存條件為2～8 ℃避光條件下可保存7 d。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：分別吸取L(+)-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL和10.0 mL，用20 g·L-1的偏磷酸溶液定容至100 mL，標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中L(+)-抗壞血酸的濃度分 別 為 1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和 100.0 μg·mL-1?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 試樣制備

試樣溶液的制備：稱取樣品約1.0 g（精確至0.001 g）于 25 mL 燒杯中，用濃度為 20 g·L-1的偏磷酸溶液將其轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，充分溶解并搖勻后定容。試樣搖勻后將其全部轉(zhuǎn)移到25 mL離心管中，用超聲機超聲提取5 min后，將試樣于4 000 r·min-1離心 5 min，取上清液。

試樣溶液的還原：用移液槍準(zhǔn)確吸取20 mL上述離心后的上清液于50 mL離心管中，加入10 mL濃度為 40 g·L-1的 L- 半胱氨酸，用 100 g·L-1磷酸三納溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，以200次/min振蕩5 min后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5～2.8，用水將溶液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，過0.45 μm水相濾膜，濾液待測。

1.3.3 儀器條件

色譜柱為 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外檢測波長245 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。流動相A的配制條件為稱取6.8 g磷酸二氫鉀與0.91 g十六烷基三甲基溴化銨，加水充分溶解混勻并定容至1 L（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5～2.8）；流動相B為甲醇（100%）；流動相A與流動相B的比例為98∶2，過濾膜，超聲脫氣。

1.3.4 建立數(shù)學(xué)模型

食品中維生素C的計算公式為

式中：X為試樣中維生素C的含量，mg/100 g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的維生素C的濃度，μg·mL-1；V為定容體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；M為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

不確定度來源主要有4類：①標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel(S)；②標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)引入的不確定度urel(c)；③樣品前處理過程中引入的不確定度urel(P)；④實驗結(jié)果的重復(fù)性測量引入的不確定度urel(A)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel(S)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度（外標(biāo)）引入的不確定度

抗壞血酸稱樣量為10 mg，純度為99.76%，不確定度為0.35%，置信區(qū)間95%，按均勻分布，k=2，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制（外標(biāo)）引入的不確定度

準(zhǔn)確稱量10 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，混勻，得1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

（1）萬分之一天平引入的不確定度。天平的稱量誤差為0.1 mg[3]，按均勻分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）10 mL容 量 瓶（A級 ） 的 允 差 為±0.020 mL[4]，按均勻分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）10 mL容量瓶（A級）定容因?qū)嶒炇覝囟茸兓鹑軇w積變化的不確定度。水膨脹系數(shù)（20 ℃）為 0.000 21 ℃-1，溫度變化為（20±5）℃，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制引入的不確定度

用 100.00 μL 移液器吸取 1.00 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.10 mL、0.05 mL、0.02 mL、0.01 mL，標(biāo)準(zhǔn)中間液體0.10 mL于不同的1.00 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，得到 100.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、20.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，水的膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃-1，按照均勻分布，量器及溫度的波動引入的不確定度見表1。

表1 量器及溫度的波動引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(c)

對標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)行測定，重復(fù)測定3次，以質(zhì)量濃度對其峰面積通過曲線擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=33.853c-14.02，相關(guān)系數(shù)為1.0。測定結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液峰面積測定結(jié)果

選取含有維生素C的樣品重復(fù)測定6次，根據(jù)峰面積帶入線性方程校正其含量，結(jié)果見表3。測得樣品中維生素C含量為c0=64.81 μg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算按公式（3），相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算按公式（4）。

式中：s為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；k為線性方程斜率，k=33.853；b為線性方程截距，b=-14.02；n為樣品平行測定次數(shù)，n=6；p為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各濃度點重復(fù)測定的次數(shù)，每個濃度點重復(fù)測定3次，p=15；c0為樣品溶液中維生素C的平均質(zhì)量濃度，c0=64.81 μg·mL-1；為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度的平均值，

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的樣品中維生素C濃度及平均樣品維生素C濃度計算結(jié)果見表3。經(jīng)計算，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c)為 0.002 2 μg·mL-1，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)為3.592×10-5。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的樣品濃度及平均樣品濃度計算結(jié)果

2.4 樣品的前處理過程引入的不確定度urel(P)

2.4.1 稱樣引入不確定度

稱取1.00 g試樣（精確至0.001 g），根據(jù)《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008），最大允許誤差為±0.005 g[3]，符合矩形分布則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4.2 樣品定容引入的不確定度

樣品前處理過程為稱樣，用偏磷酸溶解試樣并定容至50 mL，從中取2 mL用于試樣溶液的還原反應(yīng)，最終用水定容至50 mL。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），50 mL單標(biāo)線容量瓶（A級）容量允差為±0.05 mL，2 mL分度吸量管容量允差為±0.015 mL[4]，查得20 ℃時水溶液的體積膨脹系數(shù)0.000 21 ℃-1，服從矩形分布則50 mL單標(biāo)線容量瓶容量允差的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度水溶液體積膨脹的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度2 mL分度 吸 量管容量允差的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度水溶液體積膨脹的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，樣品定容過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，樣品前處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 測量重復(fù)性引入的不確定度urel(A)

選取含有維生素C的樣品同時稱取6份，按照前處理方法處理樣品，計算6次重復(fù)性結(jié)果和平均值。測定結(jié)果分別為8.13 g/100 g、8.09 g/100 g、8.10 g/100 g、8.09 g/100 g、8.09 g/100 g和8.11 g/100 g，平均值為8.10 g/100 g，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為

經(jīng)計算，測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)=0.026 1。

2.6 分析過程中不確定度分量及合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

對葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量分析過程中不確定度進(jìn)行分析和計算，過程中各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度來源、類型和數(shù)值見表4。

表4 不確定度分量

葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量分析過程中的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.7 擴展不確定度

依 據(jù) JJF 1135—2005， 其 置 信 水 平 為95%，k=2，葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的平均值為8.10 g/100 g，則擴展不確定度為

2.8 測量結(jié)果及不確定度報告

高效液相色譜法測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量，根據(jù)不確定度評定結(jié)果，當(dāng)稱樣量為1 g，置信度為95%（k=2），測定結(jié)果為（8.10±0.565）g/100 g。

3 結(jié)論

本文對使用高效液相色譜法測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的不確定度進(jìn)行了分析與評定，高效液相色譜法測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的不確定度主要來源于實驗結(jié)果的重復(fù)性測量和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。因此，在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時要選擇精密度高的計量器具，保證標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的準(zhǔn)確度，提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。