付珺 毛君 陳寶鈞

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430014)

多數(shù)早期肺癌患者無明顯癥狀，確診時(shí)已處于晚期階段〔1〕。隨著醫(yī)學(xué)水平的提高，盡管肺癌的診斷和治療有了較大改善，但肺癌患者預(yù)后仍然很差，局部晚期或轉(zhuǎn)移性肺癌患者的5年生存率低于5%〔2〕，因此，了解肺癌的發(fā)病機(jī)制并尋求新的治療靶點(diǎn)有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，長度為18～25個(gè)核苷酸。miRNA通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。研究表明，miR-637在乳頭狀甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤、宮頸癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞中異常表達(dá)，與癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔4，6〕。叉頭框蛋白(FOX)M1屬于叉頭框基因家族成員，是一種已被證實(shí)的致癌因子〔7〕。FOXM1參與細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、血管生成等過程，是臨床腫瘤治療的靶點(diǎn)〔8〕。FOXM1在肺腺癌組織中高表達(dá)，與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是肺腺癌的新型腫瘤標(biāo)志物〔9〕。非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中FOXM1高表達(dá)，RNA-149可靶向調(diào)控FOXM1的表達(dá)影響A549細(xì)胞的增殖和凋亡〔10〕。生物信息學(xué)顯示，miR-637可靶向調(diào)控FOXM1表達(dá)。但目前，miR-637在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)和其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及miR-637是否通過調(diào)控FOXM1的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲還尚未有報(bào)道。本研究探討了miR-637在肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平及其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響和作用機(jī)制，為肺癌的臨床治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A1和NCl-H460及正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均購自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫；MTT和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)和RPMI1640 購自HyClone公司；LHC-8 MEDIUM無血清培養(yǎng)基購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購自 Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；引物序列由金斯瑞生物科技公司提供；RIPA細(xì)胞裂解液購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒購自碧云天公司；FOXM1、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D、p21和p27抗體購自美國Santa Crus公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-14抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自廣州伯信生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549、SPC-A1和NCl-H460細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BEAS-2B采用LHC-8 MEDIUM無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照LipofectamineTM2000說明書操作。構(gòu)建miR-493-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞，分為miR-NC組和miR-637組，miR-NC組細(xì)胞未轉(zhuǎn)染，miR-637組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-493-3p mimics。構(gòu)建FOXM1低表達(dá)的A549細(xì)胞，分為si-NC組和si-FOXM1組，si-NC組細(xì)胞未轉(zhuǎn)染，si-FOXM1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-FOXM1。構(gòu)建miR-637和FOXM1均過表達(dá)的A549細(xì)胞，分為miR-637+pcDNA組和miR-637+pcDNA-FOXM1組，miR-216a+pcDNA組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-637與pcDNA，miR-216a+pcDNA-FOXM1組共轉(zhuǎn)染miR-637與pcDNA-FOXM1。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以2.5×104個(gè)/ml的濃度接種于96孔板中，每孔加入200 μl。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，反應(yīng)10 min后，混合均勻，使用酶標(biāo)儀于490 nm測定OD值。

1.2.4Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 將基質(zhì)膠使用不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基以1∶1的比例配置細(xì)胞外基質(zhì)膠，在Transwell小室聚碳酸酯膜上面每室加入30 μl，包被細(xì)胞外基質(zhì)膠。A549細(xì)胞胰酶消化，重懸于不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：使用未包被細(xì)胞外基質(zhì)膠的Transwell小室，上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：使用包被了細(xì)胞外基質(zhì)膠的Transwell小室，其余操作與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，取出上室，擦去小室濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，并對(duì)穿過膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，拍照。隨機(jī)選取5個(gè)視野，求平均值。

1.2.5qRT-PCR檢測基因表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入Trizol試劑提取RNA。微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度，260 nm處吸光值與280 nm處的吸光值比值大于1.8時(shí)可用于cDNA合成。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，之后 95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-493-3p和GDF15 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。取適量蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫條件下封閉1 h，加入一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，每次10 min，清洗3次。加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑，避光顯影。Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) A549細(xì)胞接種與6孔板中，待細(xì)胞融合至60%左右時(shí)用于轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為4組，miR-NC+WT-GDF15、miR-637+WT-GDF15、miR-NC+MUT-GDF15和miR-637+MUT-GDF15，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，依據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶的活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-637和FOXM1在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與BEAS-2B細(xì)胞比，肺癌細(xì)胞A549、SPC-A1和NCl-H460中miR-637均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)OXM1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明肺癌細(xì)胞miR-637呈低表達(dá)，F(xiàn)OXM1呈高表達(dá)。見表1、圖1。

表1 肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)量

圖1 FOXM1在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 miR-637組A549細(xì)胞中miR-637表達(dá)水平顯著高于miR-NC組，說明miR-637過表達(dá)的A549細(xì)胞構(gòu)建成功。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，miR-NC組和miR-637組細(xì)胞OD值均增大。培養(yǎng)48 h、72 h miR-637組細(xì)胞OD值顯著低于miR-NC組(P<0.05)，說明miR-637過表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖。與miR-NC組比，miR-637組CyclinD蛋白水平顯著降低(P<0.05)，p21和p27蛋白水平顯著升高(P<0.05)，提示miR-637過表達(dá)可能通過調(diào)控與增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖。見圖2、表2。

圖2 miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 miR-637的相對(duì)表達(dá)量及miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.3miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移侵襲的影響 miR-637組細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量均顯著低于miR-NC組(P<0.05)，說明miR-637過表達(dá)可抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲。miR-637組MMP-2、MMP-9和MMP-14均顯著低于miR-NC組(P<0.05)，提示miR-637過表達(dá)可能通過抑制MMP-2、MMP-9和MMP-14的表達(dá)抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。見表3、圖3、圖4。

表3 miR-637 過表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲的影響

圖3 肺癌A549細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色，×100)

圖4 miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4抑制FOXM1表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 si-FOXM1組FOXM1蛋白表達(dá)顯著低于si-NC組(P<0.05)，說明FOXM1低表達(dá)的A549細(xì)胞建立成功。si-NC組和si-FOXM1組細(xì)胞OD值均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大。培養(yǎng)72 h si-FOXM1組細(xì)胞OD值低于si-NC組(P<0.05)，說明抑制FOXM1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖。si-FOXM1組細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量均顯著低于miR-NC組(P<0.05)，說明抑制FOXM1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。與miR-NC組比，si-FOXM1組細(xì)胞p21蛋白水平升高(P<0.05)，CyclinD、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05)，說明抑制FOXM1的表達(dá)也能調(diào)控與增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)。見圖5、表4。

圖5 蛋白電泳

表4 抑制FOXM1表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5miR-637靶向調(diào)控FOXM1的表達(dá) 在線miRNA靶點(diǎn)預(yù)測工具預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1的3′UTR中含有與miR-637互補(bǔ)的核苷酸序列，推測miR-637可能靶向調(diào)控FOXM1表達(dá)。見圖6。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，攜帶有WT-GDF15的miR-637組細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)，而攜帶有MUT-GDF15的miR-637組細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC組無顯著差異(P>0.05)，提示miR-637可靶向調(diào)控FOXM1表達(dá)。見表5。miR-637組FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于miR-NC組(0.21±0.03 vs 0.53±0.06,P<0.05)。anti-miR-493-3p組A549細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)顯著高于anti-miR-NC組(0.85±0.09 vs 0.51±0.05，P<0.05)，見圖7。說明miR-493-3p可負(fù)向調(diào)控FOXM1表達(dá)。

1～4：miR-NC組、miR-637組、anti-miR-NC組、anti-miR-637組圖6 FOXM1的3′UTR中含有與miR-637互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 miR-637與FOXM1的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組、miR-637組、anti-miR-NC組、anti-miR-637組圖7 miR-637調(diào)控FOXM1蛋白的表達(dá)

2.6FOXM1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 miR-637+pcDNA-FOXM1組A549細(xì)胞中FOXM1蛋白水平顯著高于miR-637+pcDNA組。培養(yǎng)48 h、72 h，miR-637+pcDNA-FOXM1組細(xì)胞OD值高于miR-637+pcDNA組(P<0.05)，說明FOXM1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖作用。Transwell法檢測結(jié)果顯示，miR-637+pcDNA-FOXM1組細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量均顯著高于miR-637+pcDNA組(P<0.05)，說明FOXM1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲影響。與miR-637+pcDNA組比，miR-637+pcDNA-FOXM1組細(xì)胞p21蛋白水平降低(P<0.05)，CyclinD、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(P<0.05)，說明FOXM1過表達(dá)也能逆轉(zhuǎn)miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。見圖8、表6、表7。

1～4：miR-NC組、miR-637組、miR-637+pcDNA組、miR-637+pcDNA-FOXM1組圖8 Western印跡檢測蛋白表達(dá)

表6 FOXM1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的作用

表7 FOXM1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-637 過表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移、侵襲的作用

3 討 論

miR-637位于染色體19p13.3，具有自主轉(zhuǎn)錄單位。研究表明，miR-637在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起抑癌基因作用〔11〕。Li等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，人膽管癌組織中miR-637表達(dá)降低，miR-637過表達(dá)可抑制膽管癌細(xì)胞QBC939的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)QBC939細(xì)胞凋亡。袁青領(lǐng)等〔13〕通過構(gòu)建過表達(dá)miR-637的甲狀腺乳頭癌TPC-1細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，miR-637過表達(dá)可抑制TPC-1細(xì)胞的增殖。miR-637在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)和其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響還未見報(bào)道。本研究結(jié)果提示肺癌細(xì)胞中miR-637低表達(dá)，miR-637可能也作為抑癌基因在肺癌中發(fā)揮作用。通過構(gòu)建miR-637過表達(dá)的A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-637過表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示miR-637可能是肺癌治療的新靶點(diǎn)。細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，CyclinD是細(xì)胞周期中的關(guān)鍵蛋白〔14〕。CyclinD1驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從G0期向S期轉(zhuǎn)變，此過程受到p21與p27的負(fù)向調(diào)節(jié)〔15〕。本研究顯示，miR-637過表達(dá)可降低A549細(xì)胞CyclinD蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21和p27蛋白表達(dá)，提示miR-637過表達(dá)可能通過調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類可水解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的酶，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔16〕。本研究結(jié)果顯示，miR-637過表達(dá)抑制了A549細(xì)胞MMP-2、MMP-9和MMP-14的表達(dá)，提示miR-637過表達(dá)可能通過下調(diào)A549細(xì)胞中MMP的表達(dá)進(jìn)而抑制其遷移和侵襲。

FOXM1在肺癌組織或相關(guān)肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展〔17，18〕。本研究也顯示，肺癌細(xì)胞A549、SPC-A1和NCl-H460中FOXM1呈高表達(dá)，抑制FOXM1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。miRNA可與靶mRNA基因的3′端UTR區(qū)結(jié)合，抑制mRNA翻譯或裂解mRNA，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)〔19〕。研究顯示，miR-498可通過下調(diào)FOXM1表達(dá)抑制A549的遷移和侵襲〔20〕。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1也是miR-637的靶基因，因此，推測肺癌細(xì)胞中miR-637可能也通過調(diào)控FOXM1的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因檢測結(jié)果也證實(shí)，肺癌A549細(xì)胞中miR-637可調(diào)控FOXM1的表達(dá)。通過共轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-FOXM1與miR-637至A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-637過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，提示miR-637通過調(diào)控FOXM1表達(dá)影響A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，肺癌細(xì)胞中miR-637低表達(dá)，F(xiàn)OXM1高表達(dá)，miR-637通過負(fù)向調(diào)控FOXM1表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為miR-637作為潛在治療肺癌增殖和轉(zhuǎn)移侵襲的新靶點(diǎn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。