劉晶晶 盧麗 胡鳳琪 袁海 高丹

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院腎臟內(nèi)科,湖北 襄陽 441201)

系膜增生性腎炎是一種常見的原發(fā)性腎小球疾病，其中腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)增多和系膜基質(zhì)聚集是其主要的病理改變；隨著病情的惡化，腎小球會出現(xiàn)不同程度的硬化，最終導(dǎo)致腎衰竭〔1〕。目前，系膜增生性腎炎的治療以免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素為主，但效果并不理想〔2〕。黃芩苷是一種從中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等廣泛的藥理活性〔3～5〕。黃芩苷可通過減弱炎癥反應(yīng)和凋亡等改善糖尿病腎病、急性腎損傷和腎缺血再灌注損傷等疾病的腎功能，進(jìn)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用〔6～8〕。然而，黃芩苷在系膜增生性腎炎方面的研究較少。本研究通過觀察黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎功能、炎癥反應(yīng)和腎組織細(xì)胞凋亡的影響，探討黃芩苷改善和治療系膜增生性腎炎的可能性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑 牛血清白蛋白(美國Sigma)，白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒和尿素氮(BUN)檢測試盒、尿酸(UA)測定試劑盒、肌酐(Scr)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒(美國Promega)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥)。

1.1.2動物 6～8周齡健康雄性Wistar大鼠32只，體重200～220 g，購于鄭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。在溫度為(20.00±2.00)℃、濕度(55.00±10.00)%且通風(fēng)良好的環(huán)境中自由進(jìn)食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1系膜增生性腎炎大鼠模型的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)選取6只大鼠作為對照組，只給予等體積的生理鹽水，其余26只構(gòu)建系膜增生性腎炎大鼠模型；參照文獻(xiàn)〔2〕構(gòu)建系膜增生性腎炎大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，進(jìn)行建模。具體步驟如下：以400 mg/kg牛血清白蛋白隔日灌胃后，皮下注射0.1 ml四氯化碳(純度99.5%)和0.5 ml蓖麻油(純度99%)，每周1次，連續(xù)5 w；在第5周未聯(lián)合0.05 mg脂多糖(純度1%)生理鹽水靜脈注射。造模過程中死亡6只，剔除24 h尿蛋白定量不合格的2只后，將構(gòu)建成功的18只系膜增生性腎炎大鼠隨機(jī)分為模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組，每組各6只。所有大鼠正常飲食飲水，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組大鼠從第6周開始分別腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg 黃芩苷，每日1次，而對照組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水，每日1次。連續(xù)4 w。

1.2.2大鼠一般情況觀察 每天觀察各組大鼠的精神狀態(tài)，攝食和飲水情況，分別在造模的第6、8和10周測量大鼠的體重。

1.2.324 h尿蛋白含量的檢測 在造模的第6、8、10周未收集各組大鼠24 h的尿液，并參照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測24 h尿蛋白含量。

1.2.4血液中BUN、Scr、UA含量和IL-6、TNF-α含量的檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉后，取動脈血，室溫下靜置2 h。以2 000 r/min離心10 min取血清。分別參照BUN、Scr、UA試劑盒和IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中BUN、Scr、UA、IL-6、TNF-α的含量。

1.2.5腎組織形態(tài)學(xué)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取腎臟組織，制成厚度為3 μm的石蠟切片。采用蘇木素-伊紅、過碘酸雪夫染色，在顯微鏡高倍鏡下觀察切片中腎皮質(zhì)部分6個大小相似的腎小球，運(yùn)用高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析每個腎小球中過碘酸雪夫染色陽性的腎小球總面積和系膜基質(zhì)面積，統(tǒng)計腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)并以陽性面積與腎小球總面積的比值表示系膜基質(zhì)陽性面積比。

1.2.6腎組織細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測各組大鼠腎組織細(xì)胞的凋亡情況。將石蠟切片以二甲苯浸洗脫蠟后，以梯度乙醇進(jìn)行水化；以4%多聚甲醛固定后，采用磷酸緩沖液浸洗2次；滴加濃度為20 μg/ml的蛋白酶K稀釋液處理15 min；加入100 μl平衡液平衡10 min后，加入100 μl TUNEL反應(yīng)混合液封膜室溫反應(yīng)1 h。浸入0.3% 過氧化氫中封閉15 min后，加入100 μl辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白孵育30 min；經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色后，封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察并統(tǒng)計細(xì)胞核中被染成深棕色的陽性細(xì)胞數(shù)，即細(xì)胞凋亡數(shù)，并以陽性細(xì)胞數(shù)與100個細(xì)胞的比值表示凋亡指數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠一般情況的影響 與對照組比較，其余各組大鼠呈現(xiàn)不同程度的精神萎靡、攝食減少，體重減輕；與模型組比較，黃芩苷高、低劑量組大鼠的精神狀態(tài)和活力明顯改善，8、10 w體重有明顯升高(P<0.05)，但黃芩苷低劑量和高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠24 h尿蛋白含量的影響 造模6 w后，模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組24 h尿蛋白含量較對照組均明顯升高(P<0.05)；從造模8 w后黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組大鼠24 h尿蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05)，且黃芩苷濃度越高24 h尿蛋白含量下降越明顯(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷對大鼠體重及24 h尿蛋白含量的影響

2.3黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響 與對照組比較，模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)和系膜基質(zhì)陽性面積比值均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組中腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)和系膜基質(zhì)陽性面積比值明顯降低(P<0.05)，且黃芩苷高劑量組中這兩個指標(biāo)的下降幅度明顯大于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。見表2。

2.4黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎功能的影響 與對照組比較，模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組血清中BUN、Scr和UA含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組中BUN、Scr和UA含量均明顯降低(P<0.05)；并且，黃芩苷高劑量組中BUN、Scr和UA含量明顯低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。見表2。

2.5黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎血清中IL-6和TNF-α含量的影響 模型組、黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組血清中IL-6和TNF-α含量較對照組均明顯升高(P<0.05)，黃芩苷低、高劑量組中IL-6和TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)，并且黃芩苷高劑量組中IL-6和TNF-α含量明顯低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 右美托咪定對大鼠腎組織形態(tài)學(xué)、腎功能及IL-6、TNF-α的影響

2.6黃芩苷對系膜增生性腎炎大鼠腎組織細(xì)胞凋亡影響 與對照組(2.05±0.56)比較，模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(16.75±2.26、22.58±2.32、28.49±1.16，P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.05)，且黃芩苷高劑量組明顯高于黃芩苷低劑量組(P<0.05)。

3 討 論

系膜增生性腎小球腎炎是一種免疫介導(dǎo)的炎癥相關(guān)性疾病〔9〕，細(xì)胞增殖和凋亡失調(diào)導(dǎo)致的腎小球系膜細(xì)胞過度增殖，分泌大量炎癥因子如IL-6和TNF-α等，而這些炎癥因子又可以進(jìn)一步刺激系膜細(xì)胞增殖，導(dǎo)致系膜細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集，最終引起腎小球硬化和腎功能衰竭〔1，10，11〕。因此，有效抑制腎小球系膜細(xì)胞過度增殖并促進(jìn)其凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、改善腎功能對系膜增生性腎小球腎炎防治具有重要意義。

黃芩苷是一種天然的黃酮類化合物，因具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性而受到廣泛關(guān)注；黃芩苷可通過減弱細(xì)胞炎癥反應(yīng)和調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等在腦、心肌和肝等組織中表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用〔12～14〕。例如：Shah等〔15〕指出，黃芩苷可通過降低氧化應(yīng)激和抑制核因子-κB介導(dǎo)的炎癥因子如IL-1β和TNF-α表達(dá)減弱脂多糖誘導(dǎo)的毒性而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Luan等〔16〕指出，黃芩苷可通過激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B和抑制核因子-κB信號傳導(dǎo)抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)減輕心肌缺血再灌注損傷。此外，黃芩苷在改善腎臟相關(guān)疾病損傷方面發(fā)揮著重要作用。例如：Yang等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過降低24 h尿蛋白、尿β2微球蛋白、尿白蛋白排泄率改善腎功能，并可通過抗炎、抗氧化等多種途徑延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。楊驥等〔18〕報道，黃芩苷可通過抑制濾泡輔助T細(xì)胞分化保護(hù)狼瘡鼠腎臟損傷。奚百順等〔19〕指出，黃芩苷可通過降低腎組織中TNF-α水平改善膿毒癥大鼠早期腎功能損傷。然而，黃芩苷在系膜增生性腎小球腎炎方面的研究較少。

本研究以黃芩苷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的系膜增生性腎小球腎炎大鼠精神狀況和體重有所改善，腎功能相關(guān)指標(biāo)24 h尿蛋白、BUN、Scr和UA含量明顯降低，炎癥相關(guān)指標(biāo)IL-6和TNF-α含量降低；同時還觀察到腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)和系膜基質(zhì)陽性面積比值明顯降低，而腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高；并且，隨著黃芩苷濃度的升高，上述變化越顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與林銳珊等〔20〕研究得出的隨著黃芩苷濃度的升高，高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞增殖抑制和促細(xì)胞凋亡能力越強(qiáng)的結(jié)果部分吻合。結(jié)果表明，黃芩苷可通過抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞凋亡改善系膜增生性腎小球腎炎大鼠的腎臟損傷。提示，黃芩苷具有保護(hù)系膜增生性腎小球腎炎腎功能的作用。

總之，黃芩苷可通過減少24 h尿蛋白排泄、改善腎功能、減弱炎性浸潤和腎組織細(xì)胞凋亡改善系膜增生性腎炎大鼠腎損傷。