張洪銘 郭文軍 孫英蓮 王英軍 解生旭 徐雅娟

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

清肺化痰顆粒(QFHT)由桑白皮、地骨皮等12味中藥配伍而成，是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院的協(xié)定方劑，具有解熱、鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘的功效，其中在臨床上治療老年性哮喘方面尤為突出。臨床上應(yīng)用QFHT治療100例以上哮喘患者，總體治愈率達(dá)到85%。本課題組前期對(duì)QFHT進(jìn)行了相對(duì)完善的研究，包括提取工藝研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、藥效學(xué)研究、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，但對(duì)其平喘作用機(jī)制尚未進(jìn)行深入探討。本文采用OVA致小鼠過敏性哮喘模型，評(píng)價(jià)QFHT的平喘藥效作用，基于 UPLC-Q-Exactive-MS 代謝組學(xué)技術(shù)研究QFHT對(duì)哮喘大鼠的調(diào)控作用，分析QFHT對(duì)潛在生物標(biāo)志物的調(diào)控及相關(guān)代謝通路的作用，闡明QFHT平喘作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠(18～200)g〔許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司〕；合格證號(hào)：210726210100204453。

1.2藥品與試劑 QFHT由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院制劑室提供。地塞米松磷酸鈉注射液(遂成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：22010211)，卵清白蛋白(OUA，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，Sigma分裝，批號(hào)：BOBM10210V)，氫氧化鋁(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：2014年11月11日)，鼠白細(xì)胞介素(IL)-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：04/2021)，鼠免疫球蛋白(Ig)E ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：04/2021)，鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：04/2021)，二氯甲烷(分析純)，甲醇(質(zhì)譜純，美國(guó)fisher)。

1.3儀器 Vanquish Duo超高效液相色譜儀，Q-Ecactive質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Science)，ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)，JD300-3型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，T-1000型電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠產(chǎn)品)，GL-21M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，VCX150P13超聲波細(xì)胞破碎儀(美國(guó)SONINS公司)，PD-1C-80冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器制造有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物模型建立、分組及給藥 采用體內(nèi)注射大劑量OVA法建立過敏性哮喘模型，小鼠于第0天、7天、14天腹腔注射致敏液0.1 ml/只(含20 μg OVA和0.1 ml氫氧化鋁凝膠)，21 d開始每天霧化吸入0.5% OVA溶液20 min，連續(xù)7 d霧化激發(fā)。小鼠48只，按體重將小鼠均分4組，分別為對(duì)照組，模型組，地塞米松磷酸鈉陽(yáng)性組(1 mg/kg)，QFHT給藥組(10 g/kg)，每組12只。QFHT給藥組小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d，給藥體積為20 ml/kg，對(duì)照組、模型組給予同體積水；地塞米松磷酸鈉陽(yáng)性組在實(shí)驗(yàn)第21天開始給藥，共給藥7次。

1.4.2樣本采集 末次霧化吸入后24 h，各組小鼠摘除眼球取血，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min，分離血清，用于生化指標(biāo)的檢測(cè)及代謝組學(xué)研究。摘除眼球取血后，頸椎脫臼法處死，剪下小鼠肺組織，用生理鹽水清洗，迅速放置于液氮中保存，用于代謝組學(xué)研究。

1.4.3生化指標(biāo)的檢測(cè) 取“1.4.2”項(xiàng)下血清樣本，采用ELISA測(cè)定IgE、IL-4和TNF-α含量。

1.4.4非靶向代謝組學(xué)研究

1.4.4.1樣本制備 血清樣本制備:取50 μl血清，加入200 μl甲醇，渦旋震蕩15 s，以15 800 r/min、4℃離心10 min，取上清凍干，用純水200 μl復(fù)溶進(jìn)樣分析。按照上述操作制備血清質(zhì)控(QC)樣本。肺組織樣本制備〔1〕取約80 mg肺組織，剪碎，加入1.5 ml預(yù)冷的甲醇-水(1∶1)，破碎至均質(zhì)，以16 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，冷凍干燥，得極性提取物(LP)；取沉淀物加入1.6 ml預(yù)冷的二氯甲烷-甲醇(3∶1)，破碎至均質(zhì)，以16 000 r/min、4℃ 離心10 min，取上清液，冷凍干燥，得非極性提取物(LNP)，用純水復(fù)溶進(jìn)樣分析。按照上述操作制備肺組織 QC 樣本。

1.4.4.2色譜條件 ①血清樣本色譜條件。色譜柱：Hypersil GOLD(50×2.1 mm，1.9 μm)。流動(dòng)相為水(A)-甲醇(B)梯度洗脫：0～2 min，5%B；2～5 min，5%→35%B；5～12 min，35%→55%B；12～14 min，55%→65%B；14～20 min，65%→100% B；20～25 min，100%B；25～30 min，100%→5%B；30～35 min，5%B。流速：0.4 ml/min，柱溫：50℃，進(jìn)樣量：5 μl。②LP色譜條件。色譜柱：Hypersil GOLD(50×2.1 mm，1.9 μm)，流動(dòng)相為水(A)-甲醇(B)梯度洗脫：0～2 min，0.1%B；2～6 min，0.1%→25%B；6～10 min，25%→65%B；10～12 min，65%→75%B；12～21 min，75%→100%B；21～25 min，100% B；25～30 min，100%→0.1%B；30～35 min，0.1%B。流速：0.4 ml/min，柱溫：50℃，進(jìn)樣量：5 μl。③LNP色譜條件。色譜柱：ACQUITY HPLC HSST3(100×2.1 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相為水(A)-甲醇(B)梯度洗脫：0～1 min，72.5% B；1～6 min，72.5%→87.5% B；6～10 min，87.5%B；10～15 min，87.5%→95.0% B；15～17 min，95.0%B；17～18 min，95.0%→72.5%B；18～20 min，72.5%B。流速：0.4 ml/min，柱溫：50℃，進(jìn)樣量：5 μl。

1.4.4.3質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源(ESI)，樣品分別采用正、負(fù)離子模式檢測(cè)。噴霧電壓(+)3.8 kV，噴霧電壓(-)3.4 kV，S-LensRF電壓50 V，鞘氣流量60 Arb；輔助氣流量15 Arb；毛細(xì)管溫度300℃；一級(jí)檢測(cè)掃描范圍100～1 500 m/z，分辨率35 000。二級(jí)裂解掃描范圍100～1 500 m/z，分辨率17 500，裂解能量為10，20，30；動(dòng)態(tài)排除設(shè)為30 s。

1.4.4.4數(shù)據(jù)處理 將液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS)得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer-3.1，得到包含每個(gè)離子峰的保留時(shí)間、質(zhì)荷比(m/z)值、歸一化強(qiáng)度等信息的數(shù)據(jù)集，利用SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，篩選投影值(VIP)>1且P<0.05的離子峰作為潛在生物標(biāo)志物，通過其一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息與人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB，http：//www.hmdb.ca)中已知代謝物的碎片信息進(jìn)行比對(duì)，來實(shí)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物的鑒定。通過聚類分析觀察潛在生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)和受試者工作特征(ROC)曲線對(duì)鑒定的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)一步驗(yàn)證。利用MetaboAnalyst5.0對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié) 果

2.1生化指標(biāo)分析 與對(duì)照組相比，模型組血清中IgE、IL-4和TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，表明哮喘模型建立成功。地塞米松磷酸鈉陽(yáng)性組血清IL-4和TNF-α含量較模型組顯著下降(P<0.05)，QFHT給藥組血清IgE、IL-4和TNF-α含量較模型組顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組生化指標(biāo)比較

2.2潛在生物標(biāo)志物的篩選和鑒定 將對(duì)照組和模型組進(jìn)行OPLS-DA分析，可見兩組明顯分離，說明哮喘小鼠血清及肺組織中代謝物發(fā)生顯著變化，見圖1，同時(shí)進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，具體擬合參數(shù)見表2。

A、B為血清OPLS-DA得分圖；C、D為L(zhǎng)P OPLS-DA得分圖；E、F為L(zhǎng)NP OPLS-DA得分圖；左側(cè)為正離子模式；右側(cè)為負(fù)離子模式圖1 小鼠血清及肺組織的正交偏最小二乘判別分析

表2 置換檢驗(yàn)的擬合參數(shù)

以VIP>1，P<0.05為篩選條件，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜得到的m/z值，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)及二級(jí)質(zhì)譜碎片信息比對(duì)，血清樣本鑒定出13個(gè)潛在生物標(biāo)志物，肺組織樣本鑒定出26個(gè)潛在生物標(biāo)志物，見表3。

表3 血清和肺組織中的潛在生物標(biāo)志物

續(xù)表3 血清和肺組織中的潛在生物標(biāo)志物

2.3聚類分析 采用聚類分析的方法，直觀描述診斷哮喘的潛在生物標(biāo)志物變化趨勢(shì)，熱圖見圖2。橫軸和縱軸分別代表樣本組別和潛在生物標(biāo)志物，圖中黑色表示含量最高，白色表示含量最低，右側(cè)縱軸顯示出潛在生物標(biāo)志物的聚類。在血清和肺組織中，對(duì)照組和模型組的潛在生物標(biāo)志物有明顯的差異，驗(yàn)證了2.2鑒定的潛在生物標(biāo)志物。

圖2 血清和肺組織潛在生物標(biāo)志物的聚類分析熱圖

2.4ROC曲線分析 利用MetaboAnalyst 5.0的Biomarker Analisis功能中的多元探索性ROC曲線分析，分類方法選擇Random Forests，特征排序方法選擇SVM built-in，繪制ROC曲線來評(píng)價(jià)潛在生物標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確率。見圖3，血清和肺組織潛在生物標(biāo)志物曲線下面積(AUC)為0.998，進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選的潛在生物標(biāo)志物具有較好的診斷能力。

圖3 血清和肺組織潛在生物標(biāo)志物的ROC曲線

2.5QFHT對(duì)血清和肺組織中潛在生物標(biāo)志物的影響 QFHT可以顯著回調(diào)血清中LysoPC(20∶4/0∶0)、膽酸和肺組織中19-去甲本膽烷醇酮、PE(P-18∶1/20∶5)、環(huán)磷酸鳥苷、12-羥基二十碳五烯酸的水平，見表2。

2.6代謝通路分析 將篩選到的潛在生物標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行通路分析，共富集到14條，見圖4，其中影響值(Impact)>0.1為最主要的代謝途徑，見表3。QFHT主要通過參與AA代謝、甘油磷脂代謝和視黃醇代謝起到治療哮喘的作用。

圖4 血清和肺組織潛在生物標(biāo)志物的代謝通路分析

表3 血清和肺組織潛在生物標(biāo)志物的代謝通路分析

3 結(jié) 論

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了QFHT具有平喘的作用，代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，QFHT通過調(diào)控花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和視黃醇代謝途徑，逆轉(zhuǎn)了紊亂的潛在生物標(biāo)志物。

花生四烯酸可以被三種不同的酶代謝，即環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450酶。環(huán)氧合酶是產(chǎn)生前列腺素和血栓素最早報(bào)道代謝花生四烯酸的酶〔2，3〕，脂氧合酶可以產(chǎn)生白三烯〔4〕，細(xì)胞色素P450酶中的ω-羥化酶將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成二十碳五烯酸〔1〕。白三烯B4是一種強(qiáng)力的促炎介質(zhì)，能引起支氣管痙攣、水腫和黏液高分泌〔5〕，前列腺素E2、3可推動(dòng)人成纖維細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞的促炎反應(yīng)〔6〕。二十碳五烯酸能促進(jìn)炎癥組織中肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的停止，使巨噬細(xì)胞和TCD4+細(xì)胞分別重新編碼為M2和T調(diào)節(jié)表型，隔離和反向調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)，促進(jìn)肥大細(xì)胞凋亡，并修復(fù)受損組織〔7～9〕，同時(shí)前列腺素E1可以減輕肺部炎癥，發(fā)揮重構(gòu)氣道的作用〔10〕。本文的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，模型組與對(duì)照組相比，白三烯B4和前列腺素E2、3的水平上升，而二十碳五烯酸和前列腺素E1水平下降，口服給藥后，白三烯B4和前列腺素E2、3及二十碳五烯酸和前列腺素E1的水平均發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表明QFHT能通過調(diào)控環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450酶來參與花生四烯酸代謝途徑，起到平喘的作用。

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，而磷脂酶A2被普遍認(rèn)為與各種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔11，12〕。磷脂酶A2在肺泡表面上將PC水解為AA和LysoPC。PC參與氣道慢性炎癥的形成，能引起氣道高反應(yīng)性。AA是各種促炎二十烷酸的前體分子，LysoPC具有廣泛的促炎作用，會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞受損，進(jìn)而引起哮喘的發(fā)生〔13〕。存在生物界中的另一種磷脂-磷脂酰乙醇胺(PE)，其含量?jī)H次于PC，二者可以相互轉(zhuǎn)化。脂質(zhì)過氧化物脂質(zhì)醛與PE相結(jié)合，可形成以醛修飾的PE (al-PE) 作為炎癥介質(zhì)的新型家族，說明炎癥的發(fā)生與PE的升高也相關(guān)〔14〕，這些報(bào)道與本研究得到的結(jié)果高度一致，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的肺組織中PC(O-18∶1/16∶0)，PE(P-18∶1/20∶5)，PC(P-18∶0/18∶3)，PE(22∶6/P-18∶1)，PC(P-18∶1/20∶4)，PC(22∶2/16∶1)，PC(22∶6/18∶1)、AA水平均顯著增加，QFHT可使PC、PE和AA的水平下降，表明QFHT可通過抑制磷脂酶A2和PE的水平，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，這為QFHT通過調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝通路治療哮喘提供了依據(jù)。

視黃醇在氣道上皮的修復(fù)和肺原基的形成中起著至關(guān)重要的作用〔15〕，同時(shí)視黃醇的缺乏會(huì)導(dǎo)致其通過激活核因子(NF)-κB誘導(dǎo)，加重現(xiàn)有的炎癥〔16〕。視黃醛是視黃醇氧化后的衍生物，是由β-胡蘿卜素發(fā)生氧化斷裂生成的，還原得到視黃醇，氧化得到全反式維甲酸。本實(shí)驗(yàn)提示QFHT通過調(diào)控視黃醇代謝治療哮喘。目前國(guó)內(nèi)外運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)在通過調(diào)控視黃醇代謝途徑治療哮喘方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為視黃醇代謝機(jī)制進(jìn)一步的研究提供了新的方向。

綜上所述，QFHT給藥組能逆轉(zhuǎn)39個(gè)因OVA導(dǎo)致的潛在生物標(biāo)志物的改變，提示QFHT可能通過調(diào)控AA代謝、甘油磷脂代謝和視黃醇代謝來實(shí)現(xiàn)平喘的作用，這為臨床的合理應(yīng)用提供了理論依據(jù)。