李佳琦 張忠 王旭光 梁伊靈 薄威 付星瑋 張珉

(沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110034)

頭頸部鱗癌(HNSCC)預(yù)后極差，其5年生存率低于40%，轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅為39.1%〔1〕。多數(shù)含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING)結(jié)構(gòu)域的蛋白具有 E3 泛素連接酶活性，可以同時結(jié)合泛素化酶及其底物，導(dǎo)致底物降解，是參與泛素化途徑的重要蛋白〔2～6〕。環(huán)指蛋白超家族中包含多種蛋白成員，迄今，已發(fā)現(xiàn)含有 RING結(jié)構(gòu)域的蛋白，超過600 多種，它們大多數(shù)具有 E3 泛素連接酶活性并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和 DNA 修復(fù)等生物過程，它們的表達及活化失調(diào)與多種人類疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)〔7～10〕。環(huán)指蛋白(RNF)181基因組全長為716個堿基，編碼153個氨基酸，在胚胎及胰腺、肝臟、腎臟等25種組織中均有表達。RNF181可參與調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化及蛋白質(zhì)代謝途徑，在肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤及宮頸癌等多種腫瘤組織中RNF181的表達水平均低于癌旁組織〔11～18〕，這提示RNF181可能作為一種抑癌基因。在HNSCC組織中RNF181的表達情況，臨床病理意義及其對腫瘤進展的調(diào)控作用機制目前尚無報道。本研究主要測定RNF181在HNSC中的表達水平及探討臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院2017年6月至2018年12月經(jīng)病理確診的HNSCC 標(biāo)本62例及10例癌旁組織，其中口腔鱗癌組織41例，舌鱗癌組織9例，咽喉鱗癌組織12例。患者術(shù)前均未接受過放療、化療及免疫治療，年齡38～88歲,平均(65.03±11.85)歲。男30例，女32例，本實驗已被沈陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且患者均簽署了知情同意書。

1.2免疫組織化學(xué)染色

1.2.1主要試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2～7.6)、抗原修復(fù)緩沖液(檸檬酸法，pH6.0)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非免疫山羊血清封閉液、即用型免疫組化EliVisionplus試劑盒(鼠/兔)、辣根過氧化物酶(HRP)顯色試劑盒等均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，RNF181單克隆抗體(鼠抗人)購于美國Santa cruz公司。

1.2.2主要方法 將HNSCC組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定后，進行石蠟包埋，制作成厚度為4 μm的組織切片，切片均在統(tǒng)一條件下進行后續(xù)實驗，操作方法如下：①采用二甲苯及梯度酒精脫蠟并水化切片；②加入檸檬酸(pH6.0)抗原修復(fù)液通過高壓熱修復(fù)法進行抗原修復(fù)；③經(jīng)PBS洗滌后滴加過氧化物酶阻斷劑，在30℃下濕盒孵育30 min；④PBS洗滌后滴加非免疫山羊血清進行抗原封閉；⑤滴加RNF181一抗(1∶400)4℃過夜孵育，同時采用PBS代替一抗作為空白對照；⑥滴加EliVisionplus試劑盒中反應(yīng)增強液，30℃恒溫孵育20 min；⑦PBS洗滌后滴加酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，30℃恒溫孵育30 min，再次PBS洗滌；⑧顯色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)結(jié)合HRP顯色；⑨蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；⑩脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果判定：在每張免疫組織化學(xué)染色切片中，隨機選取10個視野(×400)，并隨機計數(shù)200個細(xì)胞，進行RNF181陽性結(jié)果判定，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：①染色強度。0為沒有染色，1為淺黃色，2為棕色，3為棕褐色；②染色范圍。陰性染色為0分，陽性細(xì)胞數(shù)為1%～10%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%為2分，3分即為陽性細(xì)胞數(shù)為51%～80%，4分即為陽性細(xì)胞數(shù)81%～100%。兩項評分相乘得最終評分，<6分為低表達，6～12分為高表達。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HNSCC細(xì)胞株Tca-8113購于上海中科院細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(美國Biological industries)在37℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RNF181過表達質(zhì)粒及對照空質(zhì)粒購于北京ORIGENE公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine3000(美國Thermo Fisher Scientific)，按照說明書推薦劑量進行轉(zhuǎn)染，48 h后提取蛋白。

1.4Western印跡 用裂解液〔50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，150 mmol/L NaCl,0.5%乙基苯基聚乙二醇(NP40),0.5%脫氧膽酸鈉，苯甲磺酰氟(PMSF)；深圳，碧云天〕提取細(xì)胞總蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法(碧云天)蛋白定量。40 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Milipore)上。用TBST(含5%脫脂奶粉)封閉后，加入一抗4℃過夜孵育。一抗稀釋比例如下：RNF181(1:800，美國，Santacruz)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、周期蛋白依賴性激酶(CDK)4、p21(1∶1 000，美國Cell Signaling Technology)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1∶20 000，美國，proteintech)。之后用過氧化物酶耦聯(lián)抗鼠或兔IgG(1∶1 000，CST)25T孵育2 h，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(Thermo)使用生物成像系統(tǒng)(上海Tanon)檢測蛋白，以GAPDH為對照，計算相對蛋白表達水平。

1.5細(xì)胞增殖實驗 根據(jù)MTT(美國Sigma)實驗方案進行。將細(xì)胞接種于6孔板中，分別轉(zhuǎn)染RNF181過表達質(zhì)粒(OE-RNF181組)及對照空質(zhì)粒(NC組)，24 h后將細(xì)胞同時接種于4個96孔板中(4×103個細(xì)胞/100 μl/孔)過夜培養(yǎng)，此后每隔24 h取出1個孔板，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT培養(yǎng)4 h，移除孔內(nèi)溶液加入DMSO(150 μl/孔)，震蕩后用酶標(biāo)儀(美國，Molecular)檢測每孔在490 nm處的光密度值。每次均有5個復(fù)孔，在相同條件下進行至少3次獨立重復(fù)實驗。

2 結(jié) 果

2.1HNSCC組織及癌旁組織中RNF181的表達差異 HNSCC組織中RNF181的蛋白表達水平顯著低于癌旁組織(2.98±2.14 vs 8.20±2.70，P<0.000 1)。

2.2HNSCC組織中RNF181的蛋白表達水平及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系 HNSCC組織中RNF181主要表達于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。RNF181在HNSCC組織中的表達水平與年齡及性別無明顯相關(guān)性，與病理發(fā)級、腫瘤直徑、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

圖1 RNF181免疫組織化學(xué)染色(×400)

表1 RNF181的表達與HNSCC臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系〔n(%)〕

2.3RNF181抑制Tca-8113細(xì)胞增殖 與NC組相比，OE-RNF181組RNF181蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。OE-RNF181組1～3 d細(xì)胞增殖能力顯著低于NC組(P<0.05)，CyclinD1和CDK4表達明顯低于NC組，而p18表達水平顯著高于NC組(P<0.05)。見圖2、圖3、表2。

圖2 Western印跡檢測RNF181蛋白表達

圖3 CyclinD1、CDK4、p18蛋白表達

表2 兩組RNF181、細(xì)胞增殖情況及CyclinD1、CDK4、p18蛋白表達比較

3 討 論

本研究結(jié)果提示RNF181可能通過調(diào)控CyclinD1、CDK4及p18等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來抑制腫瘤細(xì)胞的增長，從而發(fā)揮抑制腫瘤進展的作用。

Tan等〔19,20〕發(fā)現(xiàn) RNF181 通過泛素-蛋白酶途徑與血紅素加氧酶(HMOX)1，核糖體蛋白S27a(RPS27A)，泛素B(UBB)和金屬硫蛋白(MT)2這4種蛋白相互作用發(fā)揮腫瘤抑制作用。Brophy等〔21〕表明 RNF181 可以與整合素aⅡbβ3(Integrins aⅡbβ3)的胞內(nèi)段 KVGFFKR 基序相連接，由于 Integrins 作為細(xì)胞膜表面受體蛋白調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及相鄰細(xì)胞的結(jié)合，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并借此調(diào)節(jié)腫瘤形成，侵襲轉(zhuǎn)移等多種過程〔22〕，這一現(xiàn)象提示 RNF181 可能將泛素化過程與 Integrins 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)系起來，并參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程。目前發(fā)現(xiàn)的百余種環(huán)指蛋白超家族成員有多種生物學(xué)功能，參與調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等〔23～25〕，特別與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前對于RNF181在腫瘤中的表達情況及其作用機制研究較少。Pedersen等〔26〕發(fā)現(xiàn)RNF181 作為 E3 泛素連接酶通過抑制核因子(NF)-κB 信號通路抑制了彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長。Wang等〔11〕發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中 RNF181 表達水平低于癌旁組織，RNF181 通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路抑制肝癌 SMMC-7721 的體外生長和體內(nèi)成瘤。黃湘等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)，過表達 RNF181 可阻滯肝癌 Bel7402 細(xì)胞的細(xì)胞周期。歐燕等〔28〕的研究發(fā)現(xiàn)，用順鉑誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)凋亡后，RNF181 可通過死亡受體途徑來促進肝癌細(xì)胞株 SMMC7721 的凋亡。在王小波等〔29〕的研究中，體外試驗結(jié)果顯示，上調(diào) RNF181表達可以明顯抑制肝癌細(xì)胞 MHCC97L 的生長，反之，敲低 RNF181 則可加速細(xì)胞的生長。Wang等〔30，31〕報道了胃癌組織中 RNF181 的表達水平低于癌旁組織，并且與腫瘤分化、腫瘤大小、臨床分期及患者總生存期呈負(fù)相關(guān)。RNF181 在體外細(xì)胞學(xué)實驗及動物模型體內(nèi)實驗中均可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和增加腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制胃癌的生長。在人胃癌細(xì)胞系中，RNF181 通過抑制 ERK/MAPK 信號通路活性，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白:CyclinD1/D3、p21及CDK4/6 的表達水平，從而控制細(xì)胞周期從 G1 期到S期的進展，與細(xì)胞學(xué)試驗結(jié)果相呼應(yīng)，胃癌臨床標(biāo)本中 RNF181 的表達水平與CyclinD1、CDK4 的表達水平呈負(fù)相關(guān)，揭示了胃癌病變中RNF181-ERK/MAPK-Cyclin D1/CDK4 通路可抑制胃癌進展，RNF181可作為預(yù)測胃癌臨床結(jié)局的一種新的生物標(biāo)志物〔30,31〕。張賢等〔32〕在腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，RNF181 低表達于腸癌的癌組織，高表達于癌旁組織；在體外實驗中，下調(diào)RNF181的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(RKO)重組細(xì)胞系其生長現(xiàn)象與對照組無明顯差異，而體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào) RNF181 的 RKO 細(xì)胞系能明顯抑制裸鼠瘤體的生長，RNF181在結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞系中體內(nèi)體外調(diào)控的不同，提示腫瘤微環(huán)境與 RNF181 交互發(fā)揮調(diào)控作用。而 RNF181 對結(jié)腸癌與肝癌調(diào)控作用相反，提示 RNF181 對不同腫瘤調(diào)控作用方向不同，可能存在組織特異性。本課題組首次報道了 RNF181 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中低表達,癌旁組織中呈高表達,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示 RNF181 可能作為新的抑癌因子參與乳腺癌的調(diào)控〔33〕。此外，RNF181 在 Luminal B 型乳腺癌中呈特異性低表達，可能為乳腺癌分子分型的評判提供新的指標(biāo)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：p-ERK 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達與腫瘤的大小及組織學(xué)分級呈正相關(guān)，但與 RNF181 的表達水平無相關(guān)性，這與Wang等〔30，31〕關(guān)于肝癌及胃癌相關(guān)研究的報道結(jié)果并不符合，提示 RNF181 調(diào)控不同腫瘤進展的分子機制不盡相同，可能具有組織特異性，有待進一步深入研究。

綜上所述，RNF181在HNSCC組織中低表達且與患者不良預(yù)后相關(guān)，RN181通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、p18抑制HNSCC細(xì)胞的增長，從而起到抑癌作用。RNF181可能為HNSCC的預(yù)后判斷及靶向治療提供新的靶點，其具體調(diào)控機制尚需進一步深入研究。