逄雯珺 許梅花

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

心室重構(gòu)(VR)是指心室結(jié)構(gòu)的變化，包括心肌細(xì)胞肥大，間質(zhì)細(xì)胞(CFb)的增殖和膠原組織的增殖。VR通常發(fā)生在缺血性心肌病，例如高血壓和心肌梗死中。隨著疾病的進(jìn)展，心律不齊，心力衰竭，猝死等逐漸發(fā)生。因此盡早使用藥物干預(yù)，阻止肥厚心肌預(yù)防VR發(fā)生是治療VR的有效手段。

紅芪是甘肅的特產(chǎn)。紅芪多糖(HPS)是紅芪的主要活性成分，含量23%～34%，其具有益氣、補(bǔ)血、利尿排毒、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤等作用〔1〕。近年來有研究報(bào)道，HPS具有降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗及抗糖尿病誘導(dǎo)的心肌肥厚等作用〔2〕，在治療糖尿病方面有巨大潛力。但有關(guān)其對異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的VR的研究未見報(bào)道，本研究旨在探討HPS對ISO誘導(dǎo)的心室重構(gòu)作用及其初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，雌雄不拘，體重180～220 g，購自吉林大學(xué)億斯實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號SCXK(吉)：2019-0226。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物數(shù)確定籠數(shù)，分開飼養(yǎng)，不限制飲水量，室溫為20～25℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 HPS的提取與分離：稱取100 g完整的紅芪顆粒，用無水乙醇脫脂，加8倍量的蒸餾水，并將濾液濃縮至60%的濃度。用80%乙醇使沉淀物沉淀，并通過sevag法將沉淀物反復(fù)脫蛋白，并在真空下干燥以獲得精制的HPS。HPS含量的測定：準(zhǔn)確稱量1.000 g脫脂的干燥紅芪粉，按料液比1∶8(W/V，g/ml，下同)加至蒸餾水中至100 ml，精密萃取樣品溶液為2.0 ml，通過苯酚硫酸法測量吸光度，并通過線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中HPS的含量。ISO購自上海合豐藥業(yè)有限公司，批號201905030；羥脯氨酸(HYP)試劑盒由南京建城生物工程研究院提供，批號20190402。

1.3模型制備 動(dòng)物分組和給藥：將80只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照(CON)組、模型(ISO)組、HPS低劑量(HPS-L)組(100 mg/kg)、中劑量(HPS-M)組(200 mg/kg)、 高劑量(HPS-H)組(400 mg/kg)各15只。 在實(shí)驗(yàn)過程中，由于意外原因，剔除每組不可避免死亡數(shù)，因此，每組的最終樣本量是不同的。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔3〕，制備大鼠心室重構(gòu)模型。 除CON組外，其他組連續(xù)14 d給予ISO 2.0 mg/kg。給藥組從第2天開始灌胃給藥，灌胃給藥容積為0.02 ml/g體重量，1次/d，共計(jì)21 d，造模與給藥間隔4 h。CON組皮下注射相應(yīng)容量的生理鹽水，ISO組和CON組灌胃給予等容量的蒸餾水。末次給藥后，禁食24 h后處死動(dòng)物。

1.4心臟重量指數(shù)的測定 稱重，取眼球血→大鼠處死→開胸取心臟，用生理鹽水沖洗殘留的血液→吸干→稱量心臟的重量→計(jì)算心臟重量/體重比(HW/BW，mg/g)和左心室重量/心臟重量比(LVW/HW，mg/mg)。

1.5HYP含量測定 在心臟的心尖部取50 mg組織，鹽水沖洗后剪碎，加入1 ml水解物并充分混合。放入帶蓋的玻璃磨口試管中，加蓋后，95℃水解20 min，根據(jù)說明添加試劑，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml檢測，根據(jù)南京生物工程研究所提供的試劑盒和說明確定HYP含量。所得值/0.134就是心肌中膠原含量。

1.6心肌組織膠原蛋白Masson染色 取左心室近端1/2心肌組織，對膠原細(xì)胞進(jìn)行Masson特異性染色，用10%甲醛固定，包埋于石蠟中，切片，染色，觀察心肌組織膠原纖維在光鏡下的變化。心肌組織學(xué)觀察膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)：觀察后48 h內(nèi)，將心肌組織置于4%多聚甲醛中，用梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中，心肌組織Masson染色結(jié)果使用CISA-1000計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行。切片上每只動(dòng)物隨機(jī)抽取6個(gè)視野，并通過Brilla等〔4〕的方法測量CVF和PVCA。

1.7IH檢測心肌組織中NF-κB的表達(dá) 給藥結(jié)束時(shí)，將左心室赤道平面橫切，甲醛固定，石蠟包埋并切片，厚度為4 μm。 用Envision法檢測大鼠心臟組織中NF-κB的表達(dá)。陽性反應(yīng)為棕黃色細(xì)顆粒，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。全自動(dòng)圖像分析儀，每組隨機(jī)選擇4～6個(gè)高倍視野，自動(dòng)計(jì)數(shù)約100個(gè)細(xì)胞。Media Cybermetics Image-Pro Plus圖像分析軟件可分析CFb中表達(dá)的NF-κB的平均光密度。

1.8Western印跡檢測心肌中p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)表達(dá) 將其放置在勻漿器中，估計(jì)濕重組織體積，將3%的組織裂解液加入濕重組織體積中，并在冰盒中操作勻漿14 000 r/min，4℃ 10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新試管中，用考馬斯亮藍(lán)法定量10 μl蛋白提取物。將100 μg蛋白上樣至12%聚丙烯酰胺凝膠上，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用Lichunhong染色，并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條比較，以確定目標(biāo)片段的位置。在室溫下將封閉溶液封閉2 h，并將單克隆抗體磷酸化(P)-p38MAPK(1∶200)與PVDF膜在4℃雜交過夜。將膜用TBS洗滌30 min，并且將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體與PVDF膜雜交。在室溫下1 h后，將膜洗滌30 min并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯影。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HPS對ISO誘發(fā)VR的大鼠HW/BW，LVW/HW和HYP含量的影響 連續(xù)皮下注射ISO 14 d后，與CON組相比，ISO組HW/BW，LVW/HW和HYP水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。與ISO組比較，HPS-L、HPS-M、HPS-H組可以抑制HW/BW和LVW/HW的增加，并不同程度地降低HYP含量(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 HPS對HW/BW、LVW/HW、HYP含量影響

2.2HPS對ISO誘導(dǎo)的VR大鼠心肌組織中膠原水平的影響 CON組中正常心肌纖維排列整齊，纖維走形方向均勻一致，膠原含量極少。與CON組相比，ISO組CVF和PVCA水平明顯升高，心肌纖維發(fā)生斷裂壞死，壞死處由膠原組織填充(紅色為正常心肌纖維，綠色為心肌間質(zhì)組織中膠原纖維)。與ISO組相比，HPS各劑量組均能不同程度地減輕壞死心肌細(xì)胞數(shù)量，改善心肌纖維斷裂，降低心肌組織中膠原沉積，HPS-L、HPS-M、HPS-H組CVF、PVCA顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖1，表2。

圖1 Masson染色HPS對心肌組織中膠原水平的影響(×400)

表2 HPS對心肌組織中CVF和PVCA的影響

2.3免疫組化檢測HPS對心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響 與CON組(48.39±12.53)相比，ISO組NF-κB表達(dá)量明顯增加(126.60±26.14，P<0.01)，棕黃色染色主要集中于胞質(zhì)中，胞膜上也有表達(dá)。HSP作用后可顯著減低NF-κB的蛋白表達(dá)，與ISO組比較，HPS-L、HPS-M、HPS-H組NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(108.13±23.26、83.74±25.63、56.27±23.16，P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖2 免疫組化檢測HPS對心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)影響(×400)

2.4Western印跡檢測HPS對心肌組織中P-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與CON組(1.00±0.08)比較，ISO組P-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯升高(5.52±0.36，P<0.01)。與ISO組比較，HPS-L、HPS-M和HPS-H組P-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著降低(4.21±0.41、3.82±0.27、2.26±0.18，P<0.05,P<0.01)，見圖3。

圖3 HPS對心肌組織中P-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

連續(xù)皮下注射ISO誘導(dǎo)的VR是心臟肥大的經(jīng)典動(dòng)物模型。 ISO促進(jìn)心肌細(xì)胞總蛋白和收縮蛋白合成的增加，心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致VR，其表現(xiàn)為心臟重量增加，細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維，大量沉積等。 ISO對心肌的正性變力和變時(shí)性作用可增加心肌收縮力，增加心率，增加心肌細(xì)胞肥大，膠原纖維增生并產(chǎn)生心肌肥大〔3，5〕。

紅芪是黃芪的干燥根。因其色澤紅潤而被稱為紅芪。它的原始植物和黃芪是不同的屬，自古以來就被使用。

紅芪具有益氣固表、利尿排毒、補(bǔ)血、排膿、斂瘡生肌等功效，常用于氣虛乏力、中氣下陷、食少便澹、表虛自汗、久瀉脫肛、內(nèi)熱消渴等病癥的治療〔6〕。過去對紅芪的研究多集中在免疫調(diào)節(jié)方面，近年來研究發(fā)現(xiàn)，紅芪還具有降壓、降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗的作用，在治療高血壓、糖尿病、缺血性心肌病、心律失常、腦血管意外、腦梗死、慢性腎病等方面具有良好療效〔6〕。HPS是紅芪的主要活性成分，通過對HPS研究中采用醇沉法分離得到幾種不同分子量的多糖，用色譜法測定其構(gòu)成中發(fā)現(xiàn)幾種不同分子量多糖，均由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等單糖按不同比例構(gòu)成〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)紅芪水飽和及正丁醇提取物對超氧陰離子自由基具有清除作用〔8〕，但有關(guān)其對VR的作用報(bào)導(dǎo)較少。

p38MAPK是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，它可因生理性應(yīng)激、脂多糖、滲透性應(yīng)激和紫外線照射而激活。脂多糖、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血小板激活因子、白細(xì)胞介素-1和缺血/再灌注等炎癥刺激均可誘導(dǎo)內(nèi)源性免疫細(xì)胞如中性粒細(xì)胞內(nèi)的p38激活，p38激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并對許多蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子具有磷酸化和激活的作用〔9〕。研究表明炎癥反應(yīng)在糖尿病大鼠發(fā)生心肌纖維化、壞死和細(xì)胞凋亡的過程中起重要作用〔10〕，還有研究發(fā)現(xiàn)黃葵膠囊可通過抑制p38MAPK信號通路活性及致纖維化細(xì)胞因子、炎癥因子蛋白表達(dá)水平而改善腎纖維化〔11〕。p38在MF中的作用也有報(bào)道，p38MAPK通過調(diào)節(jié)p70S6K1活性，激活c-fos、c-jun等原癌基因，激活核因子(NF)-κB和活性蛋白(AP)-1等，引起下游目的基因的表達(dá)，導(dǎo)致心肌纖維化〔12〕。

ISO可通過激動(dòng)β1受體，通過刺激β1受體，ISO可以引起局部腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的活性增強(qiáng)，增加局部心肌組織血管緊張素Ⅱ含量，從而通過氧化應(yīng)激途徑激活MAPK信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致核因子抑制蛋白(IκB)被磷酸化降解，與NF-κB分離，從而活化NF-κB；活化的NF-κB同時(shí)促進(jìn)了一系列下游細(xì)胞因子的生成。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合在某些炎癥因子上，參與心肌肥厚及心室重構(gòu)進(jìn)程，并誘導(dǎo)原癌基因c-myc，c-fos的表達(dá)并加重心肌纖維化。諸多研究表明，VR的發(fā)生，涉及NF-κB信號激活〔13～15〕。

本研究結(jié)果證明HPS對ISO所致的VR具有抑制作用，提示ISO誘導(dǎo)的VR過程中存在p38MAPK，NF-κB信號通路激活及表達(dá)增加，這可能是ISO誘導(dǎo)的MF的發(fā)病機(jī)制之一。而HPS可通過抑制p38MAPK，NF-κB活化從而及減少心肌組織中膠原纖維的表達(dá)，對MF起到保護(hù)作用。