趙燕姣 楊鵬 羅雪蘭 周福隆 歐和生

(1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530201；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院科技部)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎性疾病，是導(dǎo)致血管疾病死亡的主要原因之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)功能紊亂和炎癥損傷是驅(qū)動(dòng)AS斑塊形成、發(fā)展和破裂的關(guān)鍵細(xì)胞事件。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是一種促AS發(fā)展的關(guān)鍵因子，其通過與LOX-1結(jié)合，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞黏附分子(ICAM)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)因子的過表達(dá)，導(dǎo)致VECs功能紊亂和炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔1〕。然而，內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中涉及的分子機(jī)制尚未完全闡明，因此，研究其中的分子機(jī)制對(duì)于尋找AS治療新藥具有重要意義。

MicroRNA(miRNA)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)〔2〕。miRNA在炎癥、細(xì)胞增生和脂質(zhì)代謝等多種細(xì)胞機(jī)制調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并參與AS的發(fā)生發(fā)展，如miR-217通過靶向SIRT1抑制巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)〔3〕；miR-155通過誘導(dǎo)ERK1/2途徑激活和NLRP3炎性體活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔4〕。近期研究提示，miR-24在腫瘤〔5〕、心肌缺血再灌注損傷〔6〕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔7〕等多種人類重大疾病中表達(dá)異常，表明miR-24與人類重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為進(jìn)一步探討miR-24對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及潛在的細(xì)胞機(jī)制，本研究通過建立體外Ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)炎癥損傷模型，探討miR-24對(duì)HUVECs炎癥損傷的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、試劑與儀器 細(xì)胞株：HUVEC購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。試劑：GV367慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因公司)；Qx-LDL(廣州奕元生物科技有限公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8，武漢博士德生物技術(shù)公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量PCR試劑盒(日本TAKERA公司)；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia)；兔抗ICAM-1、NF-κB、GAPDH和二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology)，PCR引物(生工生物有限公司)，序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(原應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 (美國(guó)Bio-Rad公司)；Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR CXL)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀Model-450(美國(guó)Thermo Forma公司)。

1.2miR-24慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司以miR-24正義序列：5'-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3'，miR-24反義序列：5'-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3'，陰性對(duì)照隨機(jī)序列：5'-GUCAUCAGUCGAGCUAGA-CGAG-3'，設(shè)計(jì)miR-24高表達(dá)、anti-miR-24和miR-NC慢病毒載體。病毒載體上含嘌呤霉素抗性蛋白，可用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.3HUVECs的培養(yǎng)、慢病毒感染和實(shí)驗(yàn)分組 用加有15%新生胎牛血清、1% 100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVECs。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。將HUVECs以細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml接種于6孔板，每孔2 ml，孵育過夜至細(xì)胞貼壁。上述3種慢病毒載體以感染指數(shù)(MOI)=70感染HUVECs。實(shí)驗(yàn)分為空白組、Ox-LDL組、miR-24+Ox-LDL組、anti-miR-24+Ox-LDL組、miR-NC+Ox-LDL組?？瞻捉M正常培養(yǎng)，Ox-LDL組給予100 μg/ml Ox-LDL 處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥損傷，其余感染組細(xì)胞均先感染相應(yīng)慢病毒載體繼而以同步法造模。應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100、200 μg/ml)Ox-LDL刺激HUVECs，并在12、24、48 h測(cè)定miR-24的表達(dá)量。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以密度8×104個(gè)/ml接種到96孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后按設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件處理細(xì)胞，然后每孔加入培養(yǎng)液100 μl和 CCK-8試劑 10 μl，避光孵育1 h，在波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm的酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值(A450 nm)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力=A450 nm實(shí)驗(yàn)組-A450 nm調(diào)零組，空白組細(xì)胞活力=A450 nm空白組-A450 nm調(diào)零組。應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100、200 μg/ml)Ox-LDL刺激HUVECs，并于12、24、48 h測(cè)定A450 nm值。

1.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 按設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件處理細(xì)胞，并將細(xì)胞以密度5×104個(gè)/ml接種于24孔板，培養(yǎng)箱中遷移24 h，0.1%結(jié)晶子染色10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈，室溫晾干，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并隨機(jī)拍照記錄，采用人工計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α的表達(dá) 將細(xì)胞以密度1×105個(gè)/ml接種于24孔板，每孔500 μl，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后按設(shè)定條件處理細(xì)胞，參照ELISA試劑盒說明書加入反應(yīng)體系檢測(cè)IL-6和TNF-α蛋白濃度。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)IL-6、TNF-α、ICAM-1的mRNA與miR-24的表達(dá)量 將細(xì)胞以密度1×105個(gè)/ml接種于6孔板，每孔2 ml，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后按設(shè)定條件處理細(xì)胞。參照RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)SYBR熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ABI Prism 7300序列檢測(cè)PCR系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。miR-24以U6為內(nèi)參，IL-6、TNF-α與ICAM-1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8Western印跡檢測(cè)ICAM-1與NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理方法同1.7。收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解各組細(xì)胞，12 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組取40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入P65、磷酸化(pP65)P65和ICAM-1相應(yīng)Ⅰ抗稀釋液(稀釋比例1∶1 000)，4℃孵育過夜。次日加入H+L熒光標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶10 000)，室溫避光孵育1 h。利用雙色熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白電泳條帶灰度值，ICAM-1以GAPDH為內(nèi)參，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值；磷酸化P65以P65為內(nèi)參，磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)量=磷酸化蛋白灰度值/總蛋白灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行ANOVA、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒感染后miR-24的表達(dá)量 與空白組(1.00±0.00)相比，miR-NC組細(xì)胞內(nèi)miR-24的相對(duì)表達(dá)量(1.07±0.09)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-24組細(xì)胞內(nèi)miR-24的相對(duì)表達(dá)量(1.85±0.15)顯著升高(P<0.05)，anti-miR-24組細(xì)胞內(nèi)miR-24相對(duì)表達(dá)量(0.44±0.10)顯著降低(P<0.05)。說明miR-24、anti-miR-24慢病毒成功感染HUVECs。

2.2Ox-LDL降低 HUVECs中miR-24的表達(dá)量 隨著Ox-LDL濃度的上升，miR-24的表達(dá)量逐漸降低；且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-24的表達(dá)量也逐漸降低。在濃度為100 μg/ml作用24 h時(shí)，miR-24的表達(dá)量變化顯著。在此基礎(chǔ)上選用100 μg/ml Ox-LDL作用 HUVECs 24 h。見表2、圖1。

圖1 miR-24對(duì)HUVECs遷移的影響(×200)

表2 不同濃度Ox-LDL對(duì)miR-24、HUVECs表達(dá)量的影響

2.3miR-24抑制IL-6、TNF-α和ICAM-1 mRNA的表達(dá) 與空白組相比，Ox-LDL組IL-6、TNF-α和ICAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著上升(均P<0.05)。與miR-NC+Ox-LDL組相比，miR-24+Ox-LDL組IL-6、TNF-α和ICAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(均P<0.05)，anti-miR-24+Ox-LDL組顯著升高(均P<0.05)。見表3。

2.4miR-24抑制IL-6、TNF-α、ICAM-1與NF-κB信號(hào)通路蛋白pP65的表達(dá) 與空白組比較，Ox-LDL組IL-6、TNF-α、ICAM-1與NF-κB信號(hào)通路蛋白pP65的表達(dá)量顯著上升(均P<0.05)。與miR-NC+Ox-LDL組相比，miR-24+Ox-LDL組IL-6、TNF-α、ICAM-1與NF-κB信號(hào)通路蛋白pP65的表達(dá)量顯著降低(均P<0.05)，anti-miR-24+Ox-LDL組顯著升高(均P<0.05)。見表3，圖2。

表3 各組細(xì)胞中IL-6、TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)量、IL-6、TNF-α、ICAM-1及pP65的蛋白表達(dá)量比較

1～5:空白組,Ox-LDL組,miR-NC+Ox-LDL組,miR-24+Ox+LDL組,anti-miR-24+Ox-LDL組圖2 miR-24抑制HUVECs中pP65與ICAM-1蛋白表達(dá)水平

3 討 論

本研究miR-24對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs炎癥損傷的影響及潛在分子機(jī)制顯示：miR-24抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷，抑制細(xì)胞增殖和遷移；miR-24通過抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活與IL-6、TNF-α、ICAM-1的分泌，參與炎癥反應(yīng)進(jìn)程。

VECs在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在受到炎癥刺激時(shí)，VECs被激活，分泌多種促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子，促進(jìn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及免疫細(xì)胞黏附并通過血管壁遷移至炎癥部位發(fā)揮炎癥效應(yīng)。長(zhǎng)期或過度炎癥反應(yīng)引起的內(nèi)皮功能障礙是AS發(fā)生發(fā)展的啟動(dòng)事件之一。其中由Ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮功能障是促進(jìn)動(dòng)AS斑塊形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素〔8〕。Han等〔9〕研究顯示，Ox-LDL可通過調(diào)控HDAC9的表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和炎癥發(fā)生，促進(jìn)AS的發(fā)展。本研究結(jié)果提示Ox-LDL通過刺激NF-κB通路激活，誘導(dǎo)HUVECs損傷和炎癥反應(yīng)發(fā)生。

miRNA是一種轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)因子，其差異性表達(dá)與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔10〕。如miR-138在Ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs炎癥反應(yīng)中下調(diào)，其通過抑制PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路激活，減輕HCAECs損傷和炎癥反應(yīng)，阻滯AS的發(fā)展〔11〕。miR-24是一種富集于VECs并高度表達(dá)的miRNA。Di Gregoli等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-24在AS斑塊中表達(dá)下調(diào)，其通過靶向抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-14的水解活性，抑制斑塊的形成。Zheng等〔13〕研究表明，miR-24在AS患者血清中表達(dá)水平顯著降低，其通過靶向抑制輸入蛋白-α3和NF-κB信號(hào)通路，抑制HUVECs炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Ox-LDL刺激HUVECs炎癥損傷后，miR-24的表達(dá)水平顯著降低。因此推測(cè)miR-24的差異性表達(dá)與Ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)。

NF-κB是一種存儲(chǔ)于未活化細(xì)胞胞質(zhì)中的快轉(zhuǎn)錄因子。正常生理情況下，NF-κB與其抑制性蛋白IκB結(jié)合處于非活化狀態(tài)；受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶復(fù)合物被激活，誘導(dǎo)NF-κB通路蛋白磷酸化，隨后NF-κB與IκB結(jié)合體解離并釋放NF-κB p65，NF-κB p65轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并與靶基因特異DNA識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，刺激細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞黏附分子，發(fā)揮促炎效應(yīng)。過量的IL-6可誘導(dǎo)VEGF作用于VECs，導(dǎo)致血管生成活性和VECs通透性增加，引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和新內(nèi)膜形成，促進(jìn)脂質(zhì)沉積，加重炎癥的發(fā)展〔14〕。TNF-α作為一種重要的炎癥介質(zhì)，通過激活VECs，誘使VECs合成與分泌ICAM-1和IL-6等炎癥細(xì)胞因子，引發(fā)內(nèi)皮功能障礙和血管損傷，導(dǎo)致血管完整性被破壞，參與炎癥反應(yīng)過程〔15〕。ICAM-1是免疫球蛋白超家族中的一員，在VECs上存在組成性表達(dá)，通過與LFA-1(αLβ2)、Mac-1(αMβ2)整合素及各種肌動(dòng)蛋白結(jié)合，誘使白細(xì)胞與內(nèi)皮黏附，并促進(jìn)白細(xì)胞穿過血管到達(dá)炎癥組織發(fā)揮促炎作用〔16〕。本研究結(jié)果提示，miR-24可能通過調(diào)控炎癥相關(guān)NF-κB信號(hào)通路的激活，及相關(guān)炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α、ICAM-1的分泌，參與Ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的進(jìn)程。

研究表明，miRNAs參與VECs的功能調(diào)節(jié)，并在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔17〕。如miR-345-3p 在HUVECs中表達(dá)降低會(huì)激活TAK1/p38/NF-κB信號(hào)通路，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和炎癥損傷，加重AS〔18〕；過表達(dá)miR-652-3p可通過抑制內(nèi)皮修復(fù)基因Ccnd2的表達(dá)，抑制VECs增殖，加速AS病變〔19〕；miR-30-5p通過靶向TCF21抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制AS的發(fā)展〔20〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-24促進(jìn)氧化損傷下HUVECs的功能障礙，并抑制血管的形成〔21,22〕。本研究結(jié)果提示miR-24可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上，在Ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs炎癥損傷模型中，miR-24可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，阻滯內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、ICAM-1，減輕HUVECs炎癥損傷，抑制細(xì)胞增殖和遷移。而下調(diào)miR-24的表達(dá)可加重HUVECs炎癥損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。