郭向東 王青玲 張夢嫻 王慶林

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 450000;2河南中醫(yī)藥大學(xué);3河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

老年性耳聾(AHL)是老年人最常見的一種感覺障礙，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其屬于“耳鳴、耳聾”等范疇，腎虛血瘀是其主要病機(jī)，“補(bǔ)腎活血、化瘀開竅”是針對AHL的主要治療方法〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，補(bǔ)腎活血湯在AHL的臨床治療中應(yīng)用廣泛且療效顯著，但其具體作用靶點(diǎn)尚不清楚，仍需進(jìn)一步探討。耳蝸毛細(xì)胞自噬減弱及凋亡增強(qiáng)是AHL的主要發(fā)病機(jī)制之一〔3，4〕，但目前從自噬和凋亡水平探討衰老狀態(tài)下的體外耳蝸毛細(xì)胞生物學(xué)功能的研究甚少。未見有研究補(bǔ)腎活血湯對衰老耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1細(xì)胞的保護(hù)作用。中藥能否通過調(diào)控自噬對衰老所致的耳蝸神經(jīng)細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用，目前鮮有報(bào)道。本研究為排除在體各因素的影響，體外培養(yǎng)小鼠耳蝸來源的耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1，利用D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)構(gòu)建衰老細(xì)胞模型，研究補(bǔ)腎活血湯對衰老HEI-OC1細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，并探討補(bǔ)腎活血湯調(diào)控衰老耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1自噬和凋亡平衡的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株HEI-OC1 由美國豪斯耳研所(House Ear Institue，USA)Fedrico Kalinec教授惠贈。

1.2實(shí)驗(yàn) 動物4周齡SPF級健康SD大鼠40只，雌雄各半，體重(150±20)g〔南京大學(xué)動物模式中心，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008〕。于SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，自由飲食和攝水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎活血湯配方顆粒(熟地黃18 g、菟絲子18 g、杜仲6 g、肉蓯蓉6 g、枸杞子6 g、補(bǔ)骨脂18 g、山萸肉6 g、獨(dú)活6 g、當(dāng)歸6 g、紅花3 g、沒藥6 g)，購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.4試劑與儀器 D-gal(Sigma，美國，批號：G5388)、胎牛血清(FBS,Gibco，美國，批號：10099133C)；DMEM(高糖)培養(yǎng)基(Gibco，美國，批號：11995040)；胰蛋白酶(Gibco，美國，批號：25200056)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(碧云天，中國，批號：C0009S)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒(S0033)(碧云天，中國，批號：C0602)；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(AnnexinV/PI)雙染試劑盒(Invitrogen，美國，批號：v13241)；抗Atg5、抗Atg12、抗Beclin1、抗p62 抗體( Cell Signaling Technology，美國，批號：12994、4180、3495、23214)；抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2抗體(Abcam，英國，批號：ab32503、ab182858)；Forma 3111型水套式CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)；BD LSR Fortessa流式細(xì)胞分析儀(美國BD)；凝膠成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad)；Tanon 6600發(fā)光成像工作站(上海天能)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.5制備補(bǔ)腎活血湯含藥血清 SD大鼠隨機(jī)分組，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組30只，空白血清(對照)組10只。按臨床體表面積換算，含藥血清組以補(bǔ)腎活血湯生藥7.41 g/(kg·d)灌胃(臨床等效劑量)、2次/d，連續(xù)7 d；對照組給予等體積蒸餾水灌胃。于末次給藥后1 h，無菌條件下腹主動脈插管取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清。56℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌、分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。用DMEM 培養(yǎng)基稀釋成低、中及高劑量組(5%、10%、20%)的補(bǔ)腎活血湯含藥血清備用。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HEI-OC1細(xì)胞置于含有10%FBS的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，33℃，10%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞密度為 80%～90%后傳代，24 h后用新鮮完全培養(yǎng)液替換培養(yǎng)液，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期即可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、衰老組、補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組，各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。對照組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后每隔12 h換液1次，衰老組直接加入20 mg/ml的D-gal處理 24 h，補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組分別加入5%、10%、20%的補(bǔ)腎活血湯含藥血清培養(yǎng)4 h，再加入D-gal 20 mg/ml繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.7MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖能力 將各組細(xì)胞按5 000個(gè)接種于96孔板，置于33℃，10%CO2條件下培養(yǎng)。在0和24 h，每孔加5 g/L的MTT 20 μl，33℃，10%CO2條件下培養(yǎng)4 h，孵育結(jié)束后，棄去各孔上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，細(xì)胞振蕩儀上振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀測定OD570。每組取12個(gè)孔的OD570平均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞的衰老狀態(tài) 先用普通光學(xué)顯微鏡拍照(200×)，再吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸出細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，3 min/次。吸出PBS，每孔加入1 ml染色工作液(β-半乳糖苷酶染色液A：10 μl，β-半乳糖苷酶染色液B：10 μl，β-半乳糖苷酶染色液C：930 μl，x-Gal溶液：50 μl)，37℃孵育過夜。普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照(200×)。

1.9Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測細(xì)胞凋亡 準(zhǔn)備適量的1×的Annexin結(jié)合液和100 μg/ml的PI工作液。收集各組細(xì)胞用4℃預(yù)冷的PBS清洗，4℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1×的Annexin結(jié)合液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml。加入5 μl Alexa Fluor?488 annexin V和1 μl 100 μg/ml PI工作液到每100 μl的細(xì)胞懸液中，室溫孵育細(xì)胞15 min，補(bǔ)充Annexin結(jié)合液400 μl，采用流式技術(shù)檢測1×104個(gè)細(xì)胞。利用 Cell Quest 軟件進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.10Western印跡檢測細(xì)胞中自噬與凋亡蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞以密度為8×104/孔接種于96孔板中，次日細(xì)胞貼壁后棄去上清培養(yǎng)液加入含有不同化合物的培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞并用 PBS洗一次，加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液提取總蛋白。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度并調(diào)整其濃度后加上樣緩沖液煮沸10 min致蛋白變性。使用十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白后，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后封閉，用 5%脫脂奶封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的Atg5、Atg12、Beclin1、p62、Bax、Bcl-2和GAPDH一抗，于4℃孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗(1∶1 000)孵育50 min。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測印跡中的陽性條帶，以GAPDH為內(nèi)參分析各蛋白相對表達(dá)水平。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1補(bǔ)腎活血湯對HEI-OC1細(xì)胞增殖的影響 HEI-OC1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的補(bǔ)腎活血湯含藥血清處理24 h后，與對照組相比，衰老組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；與衰老組相比，補(bǔ)腎活血湯各濃度組細(xì)胞活力顯著升高，并具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組HEI-OC1細(xì)胞不同時(shí)間OD570吸光度值

2.2補(bǔ)腎活血湯對HEI-OC1細(xì)胞衰老的影響 對照組中有少量衰老細(xì)胞；D-gal處理后的HEI-OC1細(xì)胞可見大量β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞陽性細(xì)胞(藍(lán)染細(xì)胞)，與對照組相比，衰老組β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，陽性染色率〔(60.86±7.61)%〕明顯高于對照組〔(11.31±2.53)%〕(P<0.01)；與衰老組相比，補(bǔ)腎活血湯各組β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，陽性染色率〔低、中、高濃度組分別為(38.38±4.92)%、(20.18±3.15)%、(13.85±2.33)%〕明顯降低(P<0.01),具有濃度依賴性，提示D-gal能誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞衰老，而補(bǔ)腎活血湯可減輕細(xì)胞衰老，見圖1。

圖1 各組HEI-OC1細(xì)胞光鏡形態(tài)和β-半乳糖苷酶染色后的陽性細(xì)胞(×200)

2.3補(bǔ)腎活血湯對HEI-OC1細(xì)胞凋亡的影響 衰老組HEI-OC1細(xì)胞的凋亡率〔(28.03±4.57)%〕明顯高于對照組〔(5.44±1.63)%；P<0.05〕，與衰老組相比，補(bǔ)腎活血湯低、中、高劑量組的凋亡率〔(17.81±3.24)%、(12.06±2.96)%、(7.73±1.31)%〕顯著降低(P<0.05)。提示補(bǔ)腎活血湯可通過降低細(xì)胞凋亡而減輕D-gal引起的HEI-OC1細(xì)胞衰老，見圖2。

圖2 各組HEI-OC1細(xì)胞雙變量流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖

2.4Western印跡分析補(bǔ)腎活血湯對HEI-OC1細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對照組相比，衰老組 Atg5、Atg12和 Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著下降，p62蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)；與衰老組相比，補(bǔ)腎活血湯各組 Atg5、Atg12和 Beclin1 蛋白表達(dá)水平顯著上升，p62 蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05；P<0.01)。提示補(bǔ)腎活血湯可通過激活自噬減輕D-半乳糖導(dǎo)致的HEI-OC1細(xì)胞衰老。與對照組相比，衰老組Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)，與衰老組相比，補(bǔ)腎活血湯各組Bax蛋白表達(dá)水平顯著下降，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05；P<0.01)。提示補(bǔ)腎活血湯可抑制凋亡減輕D-gal能引起的HEI-OC1細(xì)胞衰老，見表2、圖3。

表2 各組HEI-OC1細(xì)胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

1～5：對照組、衰老組、5%補(bǔ)腎活血湯組、10%補(bǔ)腎活血湯組、20%補(bǔ)腎活血湯組圖3 各組HEI-OC1細(xì)胞中自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

65～75歲人群中AHL的發(fā)病率高達(dá)70%～80%〔5〕。目前AHL的發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療手段極其有限，因此，研究AHL的發(fā)病機(jī)制并尋求有效治療的藥物是目前亟待解決的問題。

自噬是溶酶體對細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子蛋白進(jìn)行降解的主要途徑。它通過消化受損的線粒體、抑制活性氧的產(chǎn)生、維持染色體的穩(wěn)定等方式保護(hù)細(xì)胞免受有害物質(zhì)的損傷，延長細(xì)胞壽命〔6〕。凋亡是細(xì)胞應(yīng)激條件下，由基因調(diào)控的主動且有序的自我消亡過程。凋亡可清除機(jī)體受損和突變的細(xì)胞，是維持機(jī)體正常生理活動所必需的，但過度凋亡會引起神經(jīng)退行性疾病〔7〕。自噬和凋亡同屬于主動性死亡，雖然二者在形態(tài)特征、分子機(jī)制、生化指標(biāo)等方面不盡相同，但兩者并非相互獨(dú)立。大量研究發(fā)現(xiàn)，自噬與凋亡在發(fā)生發(fā)展過程中存在一些共同的調(diào)節(jié)因子和聯(lián)系蛋白，并在一定條件下可以交互作用、相互轉(zhuǎn)換，在組織和機(jī)體新陳代謝、損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，二者失衡與諸多疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，尤其是加速了衰老進(jìn)程〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，AHL與耳蝸毛細(xì)胞自噬的減弱及凋亡的增強(qiáng)有關(guān)，因此，調(diào)控耳蝸毛細(xì)胞自噬與凋亡的平衡可能是治療AHL的重要靶點(diǎn)。

補(bǔ)腎活血湯具有滋補(bǔ)腎精、活血化瘀的功效，與AHL腎虛血瘀的病機(jī)相結(jié)合，能有效延緩老年人的聽力下降，是治療AHL的傳統(tǒng)方劑。臨床研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血湯聯(lián)合針刺頸項(xiàng)九針治療AHL，不僅能促進(jìn)患者聽力的恢復(fù)，而且能改善患者的臨床癥狀及血液流變學(xué)指標(biāo)，從而提高患者的生活質(zhì)量，臨床療效顯著〔10〕。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡來實(shí)現(xiàn)對其他疾病的治療〔11〕，但是罕見補(bǔ)腎活血湯治療AHL機(jī)制方面的研究。

本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎活血湯能夠以濃度依賴性的方式促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)細(xì)胞活力并降低細(xì)胞的凋亡率。Bax是與凋亡關(guān)系最密切的促凋亡基因，Bcl-2則是抑凋亡基因，對Bax產(chǎn)生阻抑作用〔12〕。Huang等〔13〕發(fā)現(xiàn)mir-34a/bcl-2信號通路介導(dǎo)的耳蝸HEI-OC1細(xì)胞凋亡，在聽覺細(xì)胞老化的中發(fā)揮了重要作用，可能是AHL發(fā)生的潛在機(jī)制。本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎活血湯可提高衰老HEI-OC1細(xì)胞的存活率，其機(jī)制可能與補(bǔ)腎活血湯阻滯耳蝸HEI-OC1細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。

Atg5、Atg12和Beclin1是自噬發(fā)生過程自噬體形成的依賴性基因，其中Atg5和Atg12結(jié)合在一起，定位在自噬體雙層隔離膜的整個(gè)延長階段，是自噬體膜的標(biāo)志性分子，而Beclin1可招募其他蛋白形成自噬體，是啟動自噬的關(guān)鍵，這三者的缺失會抑制自噬的發(fā)生〔14〕。p62能與微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3-Ⅱ蛋白形成復(fù)合物，并被轉(zhuǎn)入自噬溶酶體內(nèi)降解，因此p62是一個(gè)與自噬活性呈負(fù)相關(guān)的標(biāo)志蛋白〔15〕。Xiong等〔16〕利用衰老HEI-OC1細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，sirt1因子的沉默可抑制自噬，促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞的死亡和加速聽力損失，提示自噬受損在AHL的進(jìn)展中起重要作用。本研究提示補(bǔ)腎活血湯可通過減輕耳蝸細(xì)胞自噬水平的減退來延緩衰老。

綜上，補(bǔ)腎活血湯能通過激活自噬、抑制凋亡提高衰老HEI-OC1細(xì)胞的增殖能力，改善細(xì)胞的衰老狀態(tài)，起到了對AHL神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，但自噬與凋亡發(fā)生、發(fā)展和相互作用的機(jī)制非常復(fù)雜，本文僅就補(bǔ)腎活血湯對自噬和凋亡的影響進(jìn)行了體外研究，至于其是通過何種通路來調(diào)控自噬與凋亡之間的平衡，從而發(fā)揮保護(hù)耳蝸細(xì)胞的作用等問題，將是下一步研究與探索的重點(diǎn)。