麻華膽 黃慶 鄭愛甜 劉賢彬 李政 王琳 曾娜 吳標(biāo)良

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 百色 533000；2研究生學(xué)院)

糖尿病潰瘍創(chuàng)面是糖尿病的常見并發(fā)癥，主要發(fā)生于血糖控制不良患者，代謝紊亂導(dǎo)致潰瘍創(chuàng)面愈合不良，在治療上顯得尤為棘手。濕潤燒傷膏(MEBO)是一種中藥制劑，富含β-谷甾醇、黃芩甙、小檗堿等藥理成分及亞油酸、氨基酸、糖類等營養(yǎng)成分，具有改善循環(huán)、抗炎抑菌、化癥止痛之功效并為細(xì)胞的增殖再生提供能量。實(shí)踐表明，MEBO可促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合，然而，其作用機(jī)制尚未完全明了。自噬作為一種自我保護(hù)機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)循環(huán)和組織穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。研究顯示，細(xì)胞自噬在創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成、再上皮化、創(chuàng)面重建等多環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要作用〔1〕。本文擬分析MEBT/MEBO對糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面Beclin1、LC3、p62表達(dá)的影響及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級Wistar雄性大鼠250只，3月齡，體重230～260 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 康復(fù)新液：湖南科倫制藥有限公司生產(chǎn)；MEBO：汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)；Beclin1、p-Beclin1、LC3A/B、p62抗體：Abcam公司生產(chǎn)；山羊抗兔Ig(100 μl)、β-actin抗體(100 μl)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Beclin1、LC3、p62、β-actin引物：上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3創(chuàng)面模型的建立及創(chuàng)面處理方法 大鼠予適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后分組?？瞻捉M只做備皮處理，對照組在背部建立常規(guī)創(chuàng)面模型，模型組、康復(fù)新組、MEBO組予腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型后行全層皮膚切除〔2〕。創(chuàng)面模型建立后予每日換藥2次，對照組、模型組予以生理鹽水紗布外敷，康復(fù)新組、MEBO組分別外敷康復(fù)新及MEBO紗布。各組于第1、5、11、18、25天各隨機(jī)取10只大鼠，采集創(chuàng)面組織后處死。將采集到的樣本分別用于制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片、免疫熒光染色切片、透射電鏡超薄切片及行qRT-PCR和Western印跡檢測。

1.4記錄創(chuàng)面面積并計(jì)算創(chuàng)面愈合率 分別于上述5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，將刻度尺作為參照，對創(chuàng)面進(jìn)行拍照，采用Image J軟件測定未愈合創(chuàng)面的面積并計(jì)算愈合率，創(chuàng)面愈合率=(原始的創(chuàng)面面積-未愈合的創(chuàng)面面積)/原始的創(chuàng)面面積×100%。

1.5HE染色觀察病理改變 予10%甲醛固定組織樣本，48 h后依次脫水、透明、浸蠟包埋、切片、烤片、HE染色制片，光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤、肉芽組織生長及再上皮化情況。

1.6組織切片觀察Beclin1、LC3、p62免疫熒光染色 組織切片脫蠟水化后依次進(jìn)行抗原修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、染色、封片，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞染色情況，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野(×400)，用Image J測定其OD值。

1.7電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體 組織樣本予戊二醛溶液4℃固定，再予1%鋨酸固定、梯度脫水、組織浸透、樹脂包埋，電鏡下觀察自噬體數(shù)目、形態(tài)及結(jié)構(gòu)，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞選取1個(gè)典型視野(×8 000)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的自噬體，取其平均值進(jìn)行對比。

1.8Western印跡檢測Beclin1、p-Beclin1、LC3、p62的表達(dá)水平 按照Western印跡操作規(guī)程依次提取總蛋白，測定總蛋白質(zhì)濃度并計(jì)算蛋白上樣量。制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后4℃孵育一抗過夜，翌日孵育二抗后顯影。

1.9qRT-PCR分析Beclin1、LC3、p62mRNA的表達(dá) 液氮研磨待檢組織，提取總RNA，測定總RNA濃度及質(zhì)量。將測定合格的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1創(chuàng)面愈合情況 治療第5天，對照組創(chuàng)面輕微水腫，粉紅色肉芽組織均勻分布，模型組、康復(fù)新組、MEBO組創(chuàng)面晦暗、水腫明顯，表面痂皮覆蓋，撕痂后可見少許肉芽組織形成。治療第11天，各組創(chuàng)面紅潤，可見大片鮮紅色肉芽組織形成，肉芽組織長勢相當(dāng)。治療第18天，對照組創(chuàng)面基本愈合，僅留一點(diǎn)狀疤痕；康復(fù)新組、MEBO組、模型組創(chuàng)面干燥，康復(fù)新組、MEBO組創(chuàng)面大部分上皮化，肉芽組織不明顯，模型組仍可見顆粒狀肉芽組織生長。治療第25天，對照組、康復(fù)新組、MEBO組創(chuàng)面均已愈合，模型組創(chuàng)面接近愈合，見圖1。

圖1 4組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況

2.2創(chuàng)面愈合率 第5天，各組創(chuàng)面愈合率大致相當(dāng)(P>0.05);第11天，模型組創(chuàng)面愈合率顯著低于對照組、康復(fù)新組、MEBO組(P<0.05)，對照組與康復(fù)新組、康復(fù)新組與MEBO組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第18天，對照組>MEBO組>康復(fù)新組>模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第25天，對照組、康復(fù)新組、MEBO組創(chuàng)面愈合率相當(dāng)(P>0.05)，模型組顯著低于對照組、康復(fù)新組、MEBO組(P<0.05)，見表1。

表1 4組治療不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

2.3創(chuàng)面組織病理形態(tài)學(xué) 治療第5天，對照組、模型組、康復(fù)新組、MEBO組創(chuàng)面組織大量炎癥細(xì)胞浸潤，少許成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管形成，其中模型組水腫及炎性浸潤最為明顯。第11天，各組炎癥細(xì)胞浸潤均較前減輕，大量肉芽組織形成，仍以模型組的炎癥細(xì)胞浸潤最為明顯，而成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管分布較對照組、康復(fù)新組、MEBO組稀疏紊亂。第18天，對照組可觀察到完整表皮及皮膚附屬器，康復(fù)新組、MEBO組毛細(xì)血管部分萎縮，成纖維細(xì)胞致密排列，模型組尚可見較為明顯的毛細(xì)血管網(wǎng)，成纖維細(xì)胞排列仍較為紊亂。第25天，各組可見結(jié)構(gòu)完整的皮脂腺、毛囊，組織表面表皮覆蓋，見圖2。

圖2 4組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織(HE染色，×100)

2.4Beclin1、LC3、p62免疫熒光染色結(jié)果 空白組各時(shí)相點(diǎn)及各組第1天創(chuàng)面組織內(nèi)均觀察到少量Beclin1、LC3陽性染色細(xì)胞；第5天起，創(chuàng)面模型各組可見大量陽染細(xì)胞，早期陽染細(xì)胞數(shù)明顯多于晚期。熒光強(qiáng)度分析亦顯示各組第5、11天OD值高于第18、25天，治療第5天MEBO組OD值高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p62陽性染色細(xì)胞在空白組及各組第1天創(chuàng)面組織中高度表達(dá)，第5天各組陽染細(xì)胞明顯減少，此后，可見陽染細(xì)胞數(shù)回升，熒光強(qiáng)度分析顯示各組第5、11天OD值低于第18、25天，治療第5天MEBO組OD值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3～5、表2～4。

表2 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)Beclin1 OD值比較

表3 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)LC3 OD值比較

表4 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)p62 OD值比較

圖3 5組創(chuàng)面組織Beclin1表達(dá)(免疫熒光，×400)

圖4 5組創(chuàng)面組織治療后不同時(shí)間點(diǎn)LC3表達(dá)(免疫熒光染色，×400)

圖5 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織P62表達(dá)(免疫熒光染色，×400)

2.5創(chuàng)面組織自噬體檢測結(jié)果 第1天，創(chuàng)面模型各組組織細(xì)胞內(nèi)可見少量自噬體，第5天可觀察到成纖維細(xì)胞內(nèi)多個(gè)雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，部分自噬體內(nèi)可見殘留細(xì)胞器，其中以模型組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)最少，隨后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，各組自噬體數(shù)目逐漸減少，見表5、圖6。

表5 各組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量比較

2.6Beclin1、p-Beclin1、LC3、p62蛋白檢測結(jié)果 除空白組以外，各組Beclin1、p-Beclin1的表達(dá)量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升后下降，對照組、康復(fù)新組、MEBO組于第5天表達(dá)最高，隨后逐漸降低，模型組第5天或第11天的表達(dá)量最高，表達(dá)峰值延遲，治療早期，MEBO組的表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p62的表達(dá)量下降后上升，各組第5天的表達(dá)量最低，對照組、康復(fù)新組、MEBO組于第5天達(dá)到最低值后隨即逐漸升高，模型組表達(dá)量回升延遲。治療早期，MEBO組的表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7、表6～9。

D1、D5、D11、D18、D25：第1天、第5天、第11天、第18天、第25天圖7 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織Beclin1、p-Beclin1、LC3、p62蛋白表達(dá)條帶

表6 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)Beclin1蛋白表達(dá)水平比較

表7 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)p-Beclin1蛋白表達(dá)水平比較

表8 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較

表9 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)p62蛋白表達(dá)水平比較

2.7Beclin1、LC3、p62 mRNA檢測結(jié)果 除空白組以外，Beclin1、LC3 mRNA的表達(dá)上升后下降，各組于第5天的表達(dá)量最高，對照組、康復(fù)新組、MEBO組表達(dá)量達(dá)峰值后隨即逐漸降低，模型組表達(dá)峰值延遲，于第11天表達(dá)量最高，治療早期，MEBO組第5天表達(dá)量高于模型組(P<0.05)。p62 mRNA的表達(dá)先下降后上升，各組于第5天的表達(dá)量最低，對照組、康復(fù)新組、MEBO表達(dá)量達(dá)最低值后隨即逐漸升高，模型組表達(dá)量回升延遲，治療早期，MEBO組的表達(dá)量低于模型組(P<0.05)。見表10～12。

表10 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)Beclin1 mRNA表達(dá)水平比較

表11 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)LC3 mRNA表達(dá)水平比較

表12 5組治療后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織內(nèi)p62 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

細(xì)胞自噬是真核生物進(jìn)化過程中高度保守的降解系統(tǒng)，參與細(xì)胞的新陳代謝并維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。Beclin1與自噬前體的形成有關(guān)，饑餓狀態(tài)下，活化的ULK1將Beclin1的Ser 14位點(diǎn)磷酸化，從而提高Vps34復(fù)合體的活性，Vps34是哺乳動(dòng)物中唯一的Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶(PI3K-Ⅲ)，催化磷脂酰肌醇(PI)磷酸化生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，PI3P在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜局部聚集并招募自噬相關(guān)蛋白從而促進(jìn)自噬前體的形成〔3〕。LC3是一種自噬體膜相關(guān)蛋白，在自噬流中以LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式存在，LC3Ⅰ在Agt7和Agt3的作用下，與磷酯酰乙醇胺(PE)結(jié)合后形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ黏附于自噬體膜上，參與自噬膜的形成與延伸，同時(shí)，LC3Ⅱ與p62蛋白LC3識(shí)別序列(LRS)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后形成選擇性自噬受體，介導(dǎo)泛素化蛋白的聚集〔4〕。p62是連接泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)和自噬途徑的受體蛋白，選擇性與泛素化蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體，之后自身隨泛素化蛋白一起通過自噬途徑降解〔5〕。因此，p62的蛋白水平與選擇性自噬的活性呈負(fù)相關(guān)。

本研究結(jié)果表明糖尿病狀態(tài)抑制創(chuàng)面的愈合并降低自噬水平。這與前期的研究結(jié)論一致，高糖環(huán)境〔6〕、胰島素抵抗〔7〕、糖基化終產(chǎn)物的堆積〔8〕、免疫功能紊亂〔9〕等均與創(chuàng)面愈合不良相關(guān)。長期高糖暴露下，自噬相關(guān)蛋白的合成障礙〔10〕及線粒體、溶酶體功能損害，致自噬溶酶體生成障礙〔11〕是自噬抑制的主要原因。本研究結(jié)果還表明MEBO可有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。生長因子和P物質(zhì)的高表達(dá)〔12〕及增強(qiáng)表皮干細(xì)胞的活化、增殖〔13〕被認(rèn)為是其主要作用機(jī)制。本文結(jié)果提示自噬水平的提高可能為MEBO促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制之一。在創(chuàng)面形成初期，細(xì)胞處于高度的應(yīng)激狀態(tài)，加之新生血管尚未形成，創(chuàng)面組織缺血缺氧，細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，mTORC1受抑制，引起ULK1的活化，活化的ULK1將Beclin1磷酸化，從而促進(jìn)自噬前體的形成。LC3在自噬啟動(dòng)后加強(qiáng)蛋白剪切及泛素樣反應(yīng)，形成大量LC3Ⅱ，參與自噬前體的延伸及協(xié)助泛素化蛋白進(jìn)入自噬溶酶體，因此，創(chuàng)面愈合早期Beclin1的磷酸化水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高。p62作為選擇性自噬的介導(dǎo)分子，其在創(chuàng)面愈合早期的低表達(dá)表明選擇性自噬在此時(shí)處于活躍狀態(tài)。自噬在創(chuàng)面愈合早期發(fā)揮重要作用〔1〕，一是活化中性粒細(xì)胞、提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力并向M2轉(zhuǎn)化，在增強(qiáng)固有免疫的同時(shí)及時(shí)啟動(dòng)組織修復(fù)；二是促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化。啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)后，自噬的激活有助于成纖維細(xì)胞的增殖與分化及角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移，加速新生血管形成。創(chuàng)面愈合晚期，自噬水平回落，可能為創(chuàng)面組織細(xì)胞的饑餓狀態(tài)改善，對mTORC的抑制作用減弱，從而使Beclin1的磷酸化水平及LC3轉(zhuǎn)化率逐漸降低，p62逐漸升高。關(guān)于模型組Beclin1、p-Beclin1的表達(dá)量及LC3轉(zhuǎn)化率高峰延遲或后移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測在缺乏有效藥物干預(yù)的情況下，模型組自噬水平在治療早期偏低，致愈合效率低下，乃至治療晚期，創(chuàng)面缺血缺氧仍未顯著改善，對自噬的刺激作用未明顯減弱，使得模型組Beclin1、p-Beclin1的表達(dá)量及LC3轉(zhuǎn)化率在治療晚期仍保持較高水平，這也是第25天模型組Beclin1、p-Beclin1的表達(dá)量及LC3轉(zhuǎn)化率普遍高于康復(fù)新組和MEBO組的原因所在。在創(chuàng)面重建過程中，自噬的抑制可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡及減少膠原合成〔14〕，以減少瘢痕形成，因此，創(chuàng)面愈合晚期自噬水平的低下也可能與機(jī)體基于防止瘢痕形成而作出的適應(yīng)性自噬下調(diào)有關(guān)。

綜上，MEBO可有效促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合，對細(xì)胞自噬的調(diào)控可能為其作用機(jī)制之一。藥物阻斷溶酶體降解后再測定LC3Ⅱ的水平更能體現(xiàn)自噬的改變，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有限，未能在藥物干預(yù)的條件下測定，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。