劉鵬 丁建娥 姜丹丹 丁金鈺 邵淑玲 董秀梅

血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cadherin，VE-Cad）是血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸黏附連接的主要成分，介導(dǎo)Ca2+依賴的同源性內(nèi)皮細(xì)胞黏附，是血管發(fā)育和通透性調(diào)節(jié)不可缺少的物質(zhì)[1]?？扇苄缘腣E-Cad可作為內(nèi)皮粘附素連接破壞的標(biāo)志，導(dǎo)致毛細(xì)血管滲漏、組織水腫和器官功能障礙[2]。已有研究報(bào)道證實(shí)，ABO血型不合新生兒溶血?。ˋBO-HDN）患兒的血管內(nèi)皮受到損傷，且血管內(nèi)皮損傷與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[3-5]。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔骄縑E-Cad能否預(yù)測ABO新生兒溶血病患兒血管內(nèi)皮損傷及功能障礙程度。

資料與方法

1 一般資料 選取2020年4月～2020年11月我院收集的50例ABO新生兒溶血病患兒（ABO-HDN組）和47例母嬰血型匹配的健康新生兒（對照組）作為對照。ABO-HDN組男21例，女29例，男女比例為1∶1.4；對照組男26例，女21例，男女比例為1.2∶1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會組織審核批準(zhǔn)，所有新生兒家屬均知曉參與本研究，并自愿簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他血型系統(tǒng)新生兒溶血及其他原因?qū)е碌男律鷥喝苎ǖ刂泻Ｘ氀Y、遺傳性球形紅細(xì)胞癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥等），臨床診斷為感染或CRP＞10 mg/L者，圍產(chǎn)期窒息，大的頭部血腫或嚴(yán)重的挫傷，母親吸煙或慢性高血壓、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或其他自身免疫性疾病障礙等。

2 試劑與儀器 抗-A、抗-B、ABO反定紅細(xì)胞、抗-D試劑（以上試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司提供，且在有效期內(nèi)使用），人血管內(nèi)皮鈣黏蛋白ELISA試劑盒（JL19938，江萊生物技術(shù)有限公司），低離子抗人球蛋白卡（微柱凝膠法）（批號：50531.44.10，瑞士達(dá)亞美公司）；DIANA免疫微柱孵育器（230-072-1361，西班牙基立福公司），振蕩恒溫金屬?。∕B-102，杭州博日科技有限公司），醫(yī)用離心機(jī)（T-24，邁克醫(yī)療電子有限公司），醫(yī)用離心機(jī)（BY-150C，北京白洋醫(yī)療器械有限公司），全自動血型分析儀（IH1000，美國伯樂公司），多功能自動酶標(biāo)儀（MB450，邁克醫(yī)療電子有限公司），全自動生化分析儀（DA7600，日立）。

3 研究方法

3.1 血型血清學(xué)檢測及不規(guī)則抗體篩查：將患兒標(biāo)本3 000 r/min離心5 min后，使用微柱凝膠卡在IH1000全自動血型分析儀上完成，稀釋、加樣、孵育、離心、結(jié)果判讀均由儀器自動完成，操作方法嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行。

3.2 溶血三項(xiàng)試驗(yàn)：對患兒標(biāo)本進(jìn)行溶血三項(xiàng)試驗(yàn)：直接抗人球蛋白試驗(yàn)：向抗人球蛋白檢測卡中加入50 μL洗滌后的2%～5%紅細(xì)胞懸液，并標(biāo)明“DAT”。游離試驗(yàn)和放散試驗(yàn)：①在第1、4孔分別加入A型紅細(xì)胞懸液各50 μL；在第2、5孔分別加入B型紅細(xì)胞懸液各50 μL；在第3、6孔分別加入O型紅細(xì)胞懸液各50 μL；②1～3孔分別加入50 μL新生兒血漿，4～6孔分別加入50 μL新生兒紅細(xì)胞放散液。③將檢測卡置于37℃孵育器孵育15 min。④使用專用離心機(jī)離心10 min，取出檢測卡，判讀結(jié)果。

3.3 VE-Cad檢測：采用EDTA抗凝標(biāo)本離心所得血漿進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值。所有操作均按照試劑操作說明進(jìn)行。

3.4 觀察指標(biāo)：收集兩組新生兒同期溶血指標(biāo)：血紅蛋白（Hb）、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（Ret%）、間接膽紅素（IBIL）、乳酸脫氫酶（LDH）的檢測數(shù)據(jù)。

4 結(jié)果判定 陽性結(jié)果：紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)抗體在微柱凝膠中形成的特異性抗原抗體復(fù)合物浮在凝膠表面或懸于膠中；陰性結(jié)果：紅細(xì)胞完全沉降到微柱管尖底部。反應(yīng)強(qiáng)度：特異性紅細(xì)胞抗原抗體復(fù)合物完全位于膠表面，為強(qiáng)陽性反應(yīng)；愈靠近膠底部顆粒愈小，反應(yīng)愈弱。（直抗試驗(yàn)以出現(xiàn)凝集為陽性，游離和放散試驗(yàn)均以檢出可以和新生兒紅細(xì)胞反應(yīng)的抗體為陽性）。

5 分組標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)溶血三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果：直抗、游離、放散試驗(yàn)全部陰性的，歸為對照組；放散試驗(yàn)陽性者，無論直抗、游離試驗(yàn)結(jié)果如何，均歸為ABOHDN組。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用KS（D）檢驗(yàn)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用One Way ANOVA方法分析；呈非正態(tài)分布的指標(biāo)用中位數(shù)和四分位間距表示（IQR），組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。兩因素間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 基本資料 兩組新生兒的性別、出生體重、胎齡及檢測日齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中檢測日齡為動態(tài)檢測，分布在0.5～4天之間，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組的基本資料比較

2 ABO-HDN組和對照組相關(guān)檢測指標(biāo)比較 兩組新生兒Hb、Ret%、IBIL、LDH及VE-Cad水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 ABO-HDN組和對照組相關(guān)檢測指標(biāo)的比較

3 VE-Cad水平與溶血指標(biāo)的相關(guān)性分析 ABO新生兒溶血組VE-Cad水平與IBIL、LDH、Ret%水平呈正相關(guān)，與Hb水平呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05），見圖1。

圖1 ABO新生兒溶血組VE-Cad水平與IBIL、LDH、Hb、Ret%水平相關(guān)性分析

為探索VE-Cad水平是否與IBIL、LDH、Ret%、Hb獨(dú)立相關(guān)，進(jìn)行了多重線性回歸分析，分析發(fā)現(xiàn)：調(diào)整Ret%、IBIL、LDH水平之后，ABO-HDN組的Hb水平與VE-Cad水平獨(dú)立相關(guān)；調(diào)整Hb、IBIL、LDH水平之后，ABO-HDN組Ret%水平與VE-Cad水平獨(dú)立相關(guān)；調(diào)整Hb、Ret%、LDH水平之后，ABOHDN組IBIL水平與VE-Cad水平獨(dú)立相關(guān)；調(diào)整Hb、Ret%、IBIL、水平之后，ABO-HDN組LDH水平與VE-Cad水平獨(dú)立相關(guān)（P均＜0.05）。見表3。

表3 ABO-HDN組VE-Cad水平與臨床變量間相關(guān)性的多重回歸分析

討 論

VE-Cad是構(gòu)成血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接的主要結(jié)構(gòu)分子，通過與連接素和肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白相互作用來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮屏障的穩(wěn)定性，是血管發(fā)育和通透性調(diào)節(jié)不可缺少的物質(zhì)[5]。VE-Cad可以通過三種主要形式發(fā)揮作用：完全內(nèi)吞作用、胞外區(qū)脫落或在細(xì)胞膜內(nèi)重新分布。由于在臨床情況下不可能評價(jià)完整的鈣黏附素內(nèi)吞作用或細(xì)胞膜內(nèi)再分布，因此患者外循環(huán)中脫落的可溶性VE-Cad可能作為內(nèi)皮黏附素連接破壞的標(biāo)志，導(dǎo)致毛細(xì)血管滲漏、組織水腫和器官功能障礙[6]。文獻(xiàn)研究表明炎癥介質(zhì)和生長因子，如脂多糖、腫瘤壞死因子和血管內(nèi)皮生長因子等，可以同時(shí)誘導(dǎo)多種形式的VE-Cad改變。在敗血癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和冠狀動脈粥樣硬化病中，血漿VE-Cad 水平都有所升高[7-8]。

ABO-HDN一般特指胎母ABO血型不合引起的胎兒或新生兒同種免疫性溶血性疾病，臨床表現(xiàn)有早期流產(chǎn)、新生兒黃疸、貧血、肝脾腫大、水腫等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)膽紅素腦病，甚至死亡[9]。A和B血型抗原是組織血型抗原，廣泛存在于人體組織和器官中，并且強(qiáng)烈表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面。抗-A、抗-B抗體不僅會與紅細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合引起溶血，同時(shí)也會與內(nèi)皮細(xì)胞表面的靶抗原結(jié)合引起血管內(nèi)皮的損傷[10]。已有研究通過測定血管內(nèi)皮微粒體（Endothelial Microparticles，EMPs）證實(shí)，ABO-HDN患兒的血管內(nèi)皮受到損傷，且EMPs水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[3-4]。

因此，本研究試圖通過測定內(nèi)皮功能障礙的指標(biāo)VE-Cad，來研究ABO-HDN患兒血管內(nèi)皮完整性是否受到損害以及內(nèi)皮損傷與溶血嚴(yán)重程度的關(guān)系。

與對照組相比，ABO-HDN組的血紅蛋白水平下降，網(wǎng)織紅細(xì)胞比率、間接膽紅素、乳酸脫氫酶及VE-Cad水平升高（P＜0.05）。并且，ABO-HDN組的VE-Cad水平與血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，與IBIL、LDH水平呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明ABO-HDN存在血管內(nèi)皮損傷且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，提示重度ABOHDN患兒VE-Cad水平升高可作為血管功能障礙和疾病嚴(yán)重程度的替代指標(biāo)。

目前本研究存在局限性：一是只分析了相對較小的患者群；二是沒有測定其他可溶性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如血管細(xì)胞黏附分子-1，細(xì)胞間黏附分子-1和P-選擇素等。因此，下一步的研究需擴(kuò)大樣本量并分析其他血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物，以提供更多的信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突