姜浩 李麗瑋 李志強(qiáng)

自身免疫性溶血性貧血（Autoimmune hemolytic anemia，AIHA）是一種獲得性自身免疫性疾病，在世界范圍內(nèi)每年的發(fā)病率約為（1～3）/10萬人[1]。盡管AIHA的發(fā)病率相對較低，但該病進(jìn)展較快，短時間內(nèi)即可出現(xiàn)危及生命的貧血，病死率高達(dá)11.2%。AIHA發(fā)病的特征為患者產(chǎn)生針對紅細(xì)胞的自身抗體，導(dǎo)致紅細(xì)胞在血管外被組織巨噬細(xì)胞破壞，壽命大幅度縮短[2]。根據(jù)是否存在促進(jìn)免疫失調(diào)的潛在疾?。ㄈ缌馨土?、白血病等），AIHA可分為原發(fā)性和繼發(fā)性；根據(jù)抗紅細(xì)胞抗體的最佳反應(yīng)溫度，AIHA可分為溫抗體型、冷抗體型等。AIHA的最常見類型是溫抗體型（warm AIHA，wAIHA），此型約占所有AIHA病例的80%，其發(fā)病機(jī)制主要是免疫球蛋白G（IgG）所致，其紅細(xì)胞抗體最佳反應(yīng)溫度為37℃。AIHA患者通常出現(xiàn)皮膚甲床蒼白、疲乏無力、呼吸過快、心動過速等貧血相關(guān)臨床表現(xiàn)，伴隨黃疸、肝脾腫大、感染等癥狀與體征[3]。目前，根據(jù)英國血液病學(xué)會的共識[4]，AIHA的主要治療方法包括應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑（如環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A等）、生物制劑（如利妥昔單抗等）以及輸血、脾切除等，但這些療法均有較為顯著的副作用。使用腎上腺皮質(zhì)激素（如甲基強(qiáng)的松）時，隨著給藥時間及劑量的增加，可能出現(xiàn)一系列腎上腺皮質(zhì)激素的副作用，如高血壓、糖尿病、體重增加、骨質(zhì)疏松癥、胃腸道潰瘍、免疫抑制、白內(nèi)障及焦慮癥等[5]。同時，使用激素治療后達(dá)到完全或部分緩解的患者，其中近50%會在一年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[5]。同時，二線療法脾切除亦有諸多副作用，AIHA患者脾切除術(shù)后的緩解率明顯低于自身免疫性血小板減少癥（ITP）患者，并且存在脾腫大的患者行脾切除術(shù)后形成門靜脈血栓的風(fēng)險較高，此外還可能出現(xiàn)暴發(fā)性感染如肺炎鏈球菌敗血癥[6-7]。使用免疫抑制劑治療后可發(fā)生嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥并伴有感染、肝腎功能不全等副作用。輸血治療對AIHA患者來說可謂是“雙刃劍”，該療法雖然能夠改善貧血，但患者血液中的抗紅細(xì)胞自身抗體可與輸注的紅細(xì)胞結(jié)合，從而破壞輸注的紅細(xì)胞，甚至導(dǎo)致患者貧血癥狀加重。近年來，利妥昔單抗（Rituximab）被推薦作為wAIHA的二線療法及冷凝集素型溶血性貧血（CAD）的一線治療方法。同時，也建議使用利妥昔單抗治療難治性及復(fù)發(fā)性AIHA，以獲得更高的緩解率。利妥昔單抗是針對B細(xì)胞表面蛋白CD20的單抗，其與B細(xì)胞表面CD20抗原的結(jié)合導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞凋亡，抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的致病性自身抗體的產(chǎn)生，從而減少紅細(xì)胞的破壞；另一方面，利妥昔單抗還降低了抗原呈遞細(xì)胞（APC）對致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的反應(yīng)，從而阻止B細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用，阻止AIHA致病過程的進(jìn)一步發(fā)展[8]。因此，與其他治療相比，利妥昔單抗具有更高的治療緩解率；同時因單抗具有靶向治療的特性，其不良反應(yīng)較輕，能夠有效減少激素的使用劑量及其伴隨的副作用[1]。

盡管應(yīng)用生物制劑對AIHA進(jìn)行靶向治療有著廣闊的前景，但AIHA的發(fā)病機(jī)制目前仍未明確，其涉及自身抗原，致病性抗體，補(bǔ)體系統(tǒng)、T細(xì)胞和B細(xì)胞異常，以及多克隆淋巴細(xì)胞的活化和多種細(xì)胞因子產(chǎn)生等多個病理過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，特定的淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子與AIHA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[9-11]，這些可能會成為生物制劑的作用靶點(diǎn)。因此，有必要進(jìn)一步明確與AIHA發(fā)病密切相關(guān)的淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子，重新評估其在AIHA疾病進(jìn)程中發(fā)揮的作用，以便探索更多的藥物作用靶點(diǎn)。本文主要闡述B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子和Ca2+-calcineurin-NFAT通路與AIHA發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。

1 B淋巴細(xì)胞與AIHA的相關(guān)性 B淋巴細(xì)胞在AIHA的發(fā)病中起主要作用，它們產(chǎn)生針對紅細(xì)胞抗原的致病性自身抗體。大多數(shù)AIHA為溫抗體型，抗體主要為IgG類[1]。IgG自身抗體通過抗體依賴性細(xì)胞毒性作用（ADCC）破壞紅細(xì)胞，該作用由單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)驅(qū)動。巨噬細(xì)胞表面存在IgG Fc區(qū)表面受體，通過與IgG Fc片段結(jié)合介導(dǎo)對紅細(xì)胞的吞噬，由此導(dǎo)致溶血性貧血的發(fā)生[9]。在自身免疫性疾病中，B細(xì)胞對自身抗原的反應(yīng)是通過誘導(dǎo)和增強(qiáng)外周淋巴器官的生發(fā)中心（GC）反應(yīng)進(jìn)行的[12-13]。在GC中激活的抗原特異性B細(xì)胞會經(jīng)歷克隆擴(kuò)增、B細(xì)胞受體細(xì)胞突變、抗體親和力成熟和類別轉(zhuǎn)換（從IgM、IgD轉(zhuǎn)變?yōu)橥N抗體IgG、IgA、IgE），最終分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞[14]。這些過程促進(jìn)了針對紅細(xì)胞抗原的致病性自身抗體產(chǎn)生，造成紅細(xì)胞破壞，從而導(dǎo)致了AIHA的發(fā)生。除了在產(chǎn)生和分泌自身抗體中發(fā)揮作用外，B細(xì)胞還通過產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子并充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞（APC）使T細(xì)胞活化，推動免疫介導(dǎo)AIHA的發(fā)病過程[15]。

2 T細(xì)胞亞群與AIHA的相關(guān)性

2.1 CD4+Th1/Th2細(xì)胞：根據(jù)分泌的標(biāo)志性細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）等，Th細(xì)胞可分為Th1和Th2細(xì)胞亞群[15]。Th1細(xì)胞能夠分泌白介素12（IL-12）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-β（TNF-β），進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞、誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和清除胞內(nèi)病原體。Th2細(xì)胞能夠分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，這些炎癥因子具有激活體液免疫、促進(jìn)抗體生成的作用[17]，提示Th2細(xì)胞可能在各種自身抗體介導(dǎo)的疾?。ㄈ鏏IHA）的發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。與健康對照者相比，AIHA患者的IFN-γ和Treg水平降低導(dǎo)致對Th2反應(yīng)的抑制作用降低，從而導(dǎo)致自身抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)展[18]。FAGIOLO E等的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，AIHA患者IL-4的基礎(chǔ)合成水平增加，IFN-γ水平降低，Th1細(xì)胞因子減少，Th2細(xì)胞因子增加，Th1/Th2淋巴細(xì)胞比例失衡，從而促進(jìn)了AIHA的發(fā)生發(fā)展。該研究同時也發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞因子減少、Th2細(xì)胞因子增加所致的AIHA自身抗體產(chǎn)生可能繼發(fā)于IL-10/IL-12比例失衡[19]。另外，在AIHA患者中發(fā)現(xiàn)了IL-12的水平下調(diào)以及IL-10/IL-12比例失衡[20]。這些與AHMAD E等的研究結(jié)果相一致，他們也認(rèn)為IL-10/IL-12比例失衡可能在AIHA的發(fā)生和/或維持中發(fā)揮重要作用[21]。

2.2 Th17細(xì)胞：Th17細(xì)胞是由初始CD4+T細(xì)胞在IL-23和IL-1β的刺激下分化而來，是特異性免疫刺激反應(yīng)中產(chǎn)生IL-17的主要細(xì)胞。Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-21、IL-22，以及它的標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A和IL-17F[22]。XU L等的研究發(fā)現(xiàn)在AIHA患者中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，與疾病活動度密切相關(guān)，與抗紅細(xì)胞IgG抗體水平、乳酸脫氫酶（LDH）活性呈正相關(guān)，與血紅蛋白、血清補(bǔ)體C3呈負(fù)相關(guān)。在AIHA小鼠模型研究中，Th17細(xì)胞亦與AIHA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Th17細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移增強(qiáng)了抗小鼠紅細(xì)胞抗體反應(yīng)并促進(jìn)AIHA的發(fā)作，而體內(nèi)應(yīng)用抗IL-17的中和抗體能夠抑制該疾病的發(fā)生發(fā)展[23]。MEIKE MITSDOERFFER等發(fā)現(xiàn)在與Th17細(xì)胞和抗原共培養(yǎng)的條件下，B細(xì)胞的增殖明顯增加，并且Th17細(xì)胞能夠促進(jìn)生發(fā)中心（GC）的產(chǎn)生[22]。另外，Th17細(xì)胞能誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖、漿細(xì)胞生成，以及促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致AIHA的病理性進(jìn)展[22]。Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IL-21均能誘導(dǎo)向IgG抗體的類別轉(zhuǎn)換[22]。有報道稱IL-17本身不會誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖[24]，而是IL-21在CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞的協(xié)同作用下誘導(dǎo)了B細(xì)胞的擴(kuò)增和漿細(xì)胞的生成。因此，在Th17細(xì)胞存在的情況下，B細(xì)胞增殖明顯增加可能是由于Th17細(xì)胞大量產(chǎn)生IL-21所致 。

2.3 CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞：CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）是由初始CD4+T細(xì)胞分化而來的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，主要起免疫抑制作用。它的主要表型特征為細(xì)胞表面表達(dá)CD4、CD25（白介素2受體α鏈）以及組成性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在外周耐受的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用，可阻止AIHA及其他多克隆自身免疫性疾病的發(fā)生[25]。Treg細(xì)胞發(fā)育異?；蚬δ苁д{(diào)是多種自身免疫性疾病的免疫特征，AHMAD E等發(fā)現(xiàn)AIHA患者的循環(huán)血中CD4+Treg細(xì)胞降低[21]。AMINA MQADM等的研究發(fā)現(xiàn)在Playfair和Marshall-Clarke小鼠AIHA模型[26]中，耗竭CD4+CD25+Treg細(xì)胞可將AIHA的發(fā)病率從30%提高至90%。然而，在過繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg細(xì)胞的小鼠中，自身抗體的產(chǎn)生被完全抑制[11]。

2.4 TFH/TFR細(xì)胞：濾泡輔助T細(xì)胞（TFH）是高度特異性的CD4+淋巴細(xì)胞亞群，在小鼠、人類和非人類靈長類動物中被鑒定為CXCR5hiPD1hiBcl6hiCD4+T細(xì)胞。TFH細(xì)胞的特征在于表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子B細(xì)胞淋巴瘤6蛋白（Bcl-6）、趨化因子受體CXCR5、誘導(dǎo)型共刺激物（ICOS）、細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）和產(chǎn)生高水平的白介素21（IL-21）。其主要功能是支持生發(fā)中心（GC）的形成和反應(yīng)，為B細(xì)胞提供必需的成熟信號，驅(qū)動抗體類別轉(zhuǎn)換，促進(jìn)自身抗體的異常產(chǎn)生并促進(jìn)免疫記憶形成[27]。

YUHAN GAO等研究發(fā)現(xiàn)TFH在誘導(dǎo)AIHA中起重要的促進(jìn)作用[10]。IL-21是TFH細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，影響B(tài)細(xì)胞的增殖、存活和同種型轉(zhuǎn)換，為B細(xì)胞和TFH細(xì)胞提供雙向促進(jìn)信號[28]。另外，IL-21可誘導(dǎo)漿細(xì)胞分化，免疫球蛋白產(chǎn)生和免疫球蛋白向IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的類別轉(zhuǎn)換[22]。因此，通常TFH細(xì)胞的存活和功能發(fā)揮必須依賴IL-21。ICOS在CD4+TFH細(xì)胞分化過程中高度表達(dá)，是上調(diào)Bcl-6的表達(dá)和TFH細(xì)胞分化程序中控制Bcl-6所必需的。Bcl-6是CD4+TFH的主要調(diào)節(jié)因子，控制CD4+T細(xì)胞中下游的CXCR5表達(dá)，從而建立了TFH細(xì)胞從ICOS、Bcl-6到CXCR5分化的分子層次，即ICOS信號誘導(dǎo)Bcl-6表達(dá)，隨后誘導(dǎo)CXCR5高表達(dá)[29]。趨化因子受體CXCR5的表達(dá)使TFH遷移到B細(xì)胞濾泡和生發(fā)中心富含CXCL13的區(qū)域，從而刺激活化的B細(xì)胞成為長壽命、分泌抗體的漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞[30]。IL-6和IL-21通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）上調(diào)Bcl-6和CXCR5的表達(dá)，此途徑在TFH細(xì)胞的分化和功能維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31-32]。

濾泡調(diào)節(jié)T細(xì)胞（TFR）代表高度專業(yè)化的Foxp3+Treg細(xì)胞的亞群，TFR細(xì)胞的特征在于表達(dá)CXCR5、PD-1、ICOS、CTLA-4和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、Blimp1、Bcl-6。TFR細(xì)胞的功能可分為維持自我耐受和促進(jìn)有效的體液反應(yīng)[33]。DAVIDE BOTTA等的研究表明，在沒有TFR細(xì)胞的情況下，流感病毒感染模型中會出現(xiàn)自身反應(yīng)性抗體分泌細(xì)胞。這表明TFR細(xì)胞的功能之一是防止自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆的擴(kuò)增，維持有效的體液反應(yīng)[34]。RACHEL L CLEMENT等研究發(fā)現(xiàn)缺乏TFR細(xì)胞的小鼠血清中存在自身反應(yīng)性IgG和IgE[35]，也證明了TFR細(xì)胞在體液反應(yīng)中發(fā)揮的積極作用。但是目前對于TFR細(xì)胞如何促進(jìn)有效的體液反應(yīng)尚未研究透徹。在自身免疫性疾病如兒童免疫性血小板減少癥患者血中觀察到TFR/TFH比例失衡，外周血TFR細(xì)胞比例減少、TFH細(xì)胞比例增加[36]。TFR細(xì)胞具有抑制TFH激活和產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，并且能通過CTLA-4的高表達(dá)以及產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）來抑制生發(fā)中心的B細(xì)胞GL7和B7-1表達(dá)以及限制類別轉(zhuǎn)換重組[37-38]。因此，TFR細(xì)胞通過抑制TFH激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、抑制生發(fā)中心B細(xì)胞激活及限制類別轉(zhuǎn)換重組，在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)及阻止AIHA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。另外，YUHAN GAO等研究發(fā)現(xiàn)在AIHA小鼠模型中，TFH/TFR的比例增加，血清IL-21和IL-6水平升高，以及Bcl-6和c-Maf表達(dá)上調(diào)[10]。

3 Ca2+-calcineurin-NFAT通路與AIHA的相關(guān)性 活化的T細(xì)胞核內(nèi)因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）家族在T細(xì)胞的細(xì)胞因子基因表達(dá)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NFAT轉(zhuǎn)錄因子家族有5個家族成員：NFAT1（NFATc2或NFATp）、NFAT2（NFATc或NFATc1）、NFAT3（NFATc4）、NFAT4（NFATx或NFATc3）和NFAT5，其中NFAT1-4是由Ca2+信號調(diào)節(jié)的，由鈣/鈣調(diào)素依賴性磷酸酶定位至細(xì)胞核[39]。抗原激活T細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin）隨之被激活。這種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶通過其去磷酸化激活胞質(zhì)NFAT，從而使得活化的NFAT移位至細(xì)胞核，NFAT差異性地調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育、活化和分化相關(guān)基因的表達(dá)，同時產(chǎn)生不同的炎性細(xì)胞因子[40-41]。近年來，在自身免疫性疾病中，Ca2+-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT1-4通路失調(diào)方面已有相關(guān)報道。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，環(huán)孢菌素（CsA）和他克莫司已被用于治療諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）等自身免疫疾病[42]。

RENGARAJAN J等的研究發(fā)現(xiàn)，缺乏NFAT2的小鼠表現(xiàn)出IL-4和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生受損，IgG1和IgE水平降低[43]，提示NFAT2途徑可能在AIHA的發(fā)病中發(fā)揮作用。NFAT1和NFAT2都能夠直接與IL-17啟動子區(qū)結(jié)合[44]。CD4特異性NFAT2缺陷小鼠中IL-17表達(dá)降低，NFAT1和NFAT2缺陷小鼠（DKO）中IL-17表達(dá)也降低[45]，且NFAT1能夠直接結(jié)合IL-10、IL-17基因座的遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)。因此，NFAT1的過度活化及對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的親和力增加，能夠使IL-10和IL-17的產(chǎn)生增加[46]。此外，CD4+特異性NFAT2缺陷小鼠表現(xiàn)出RORγt水平降低，而RORγt是Th17的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，故NFAT2水平降低導(dǎo)致IL-17A、IL-17F和IL-21產(chǎn)生減少[47]。TFH細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞均表達(dá)高水平的NFAT1和NFAT2，缺乏NFAT2的T細(xì)胞IgG1和IgE水平降低，表明NFAT家族在體液免疫中的功能重要性。此外，NFAT調(diào)控一些分子的表達(dá)，如干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）、PD-1和 CXCR5，這些分子對于TFH細(xì)胞的功能和分化至關(guān)重要[48]。同時，NFAT是IL-21產(chǎn)生所必需的轉(zhuǎn)錄因子，IL-21對TFH的分化和功能發(fā)揮有重要作用，這一過程能夠被環(huán)孢素A阻斷[49]。在淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）感染模型中，缺乏NFAT1/2小鼠表現(xiàn)出TFH細(xì)胞分化受損[50]。因此，NFAT是生發(fā)中心TFH細(xì)胞分化和功能形成必不可少的因子，在AIHA的致病中也發(fā)揮著重要作用。

總之，淋巴細(xì)胞亞群及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子和Ca2+-calcineurin-NFAT通路在AIHA中發(fā)揮重要的作用。但它們發(fā)揮作用的諸多途徑仍未完全明確。為了增加治療途徑、提高治療效果，應(yīng)對影響AIHA致病性自身抗體產(chǎn)生的因素、疾病進(jìn)程中相關(guān)的淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子的作用途徑、Ca2+-calcineurin-NFAT相關(guān)信號通路進(jìn)行深入研究，以發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突