趙陽 胡曉玉 王超 陳美梅 趙娜娜 於娟 呂蓉

在臨床中很多種疾病會導(dǎo)致血小板數(shù)量減少，當(dāng)血小板數(shù)量降至一定數(shù)值時，如不能夠及時輸注血小板，可能會出現(xiàn)顱內(nèi)、內(nèi)臟出血等，危及患者生命。目前在臨床治療中只進行ABO血型系統(tǒng)的血小板配合性輸注，常會遇到患者多次輸注血小板后出現(xiàn)血小板輸注無效的棘手問題。引起血小板輸注無效的原因有免疫性因素和非免疫性因素，其中免疫性因素主要包括人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的抗體、血小板同種抗原（human platelet antigen，HPA）的抗體、CD36抗體等。在血小板輸注過程中，如果血小板同種抗原不相匹配，受血者機體產(chǎn)生血小板同種抗體，會引發(fā)同種免疫性血小板減少癥、輸血后紫癜（NAITP）、血小板輸注無效（PTR）、新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜（NAITP）等[1]。據(jù)文獻報道大約2%～11%長期輸注血小板患者會產(chǎn)生抗-HPA[2]。不同人群HPA基因型別有一定的差異。通過HPA基因分型檢測可以實現(xiàn)同種型別的個體進行血小板輸注，從而有效減少同種血小板抗體的產(chǎn)生。因此，對本地區(qū)單采血小板捐獻者血樣進行HPA基因分型檢測，并探討檢測方法的建立，建立適合本地區(qū)庫容的血小板捐獻者資料庫，實現(xiàn)HPA基因型的同型輸注或配合性輸注，減少患者輸注血小板產(chǎn)生抗體的發(fā)生，提高血小板輸注的效果有重要的意義[3]。

材料與方法

1 樣本來源

1.1 無償捐獻單采血小板人群：隨機抽取2020年4月1日～2020年12月1 日自愿無償參加安徽省血液中心單采血小板捐獻者1 181名。年齡：18～55周歲。男性：944名；女性：237名。獻血次數(shù)3次或3次以上獻血者：483名；首次獻血者：451名。A型獻血者；364名;B型獻血者：297名；O型獻血者：410名；AB型獻血者：110名。此項實驗已獲倫理委員會審批，且均已簽署知情同意書。

1.2 驗證方法選取的標本：在1 118名無償捐獻者中隨機抽取22人血樣，此22份樣本中包含了利用多重?zé)晒釶CR法HPA分型檢測結(jié)果為低頻抗原的樣本，使用SBT方法進行HPA分型檢測。

2 試劑與儀器

2.1 試劑：磁珠法血液DNA提取試劑盒（批號：MD5111-02，Magen）；人類血小板特異性抗原HPA1-6/10/15/21基因分型檢測試劑盒（多重?zé)晒釶CR法）（批號：202101B/202201，偉禾生物）；HPA基因測序試劑盒（PCR-SBT法）（批號：K202011006，秀鵬生物）。

2.2 儀器：離心機（日本久保田）；KingFisherFlex全自動磁珠提取純化系統(tǒng)（Thermo公司）；濃度測定儀（eppendorf）；7500熒光定量PCR儀（ABI公司）;3730基因測序儀（ABI公司）。

3 方法

3.1 提取樣本DNA：采用磁珠法提取單采血小板捐獻者抗凝血樣DNA，將200 μL血樣和相應(yīng)的試劑加入到深孔板和淺孔板中，按照要求運行全自動磁珠提取純化系統(tǒng)。實驗結(jié)束后將淺孔板中DNA轉(zhuǎn)移到對應(yīng)編號的EP管中。取10 μLDNA樣本使用濃度測定儀檢測DNA濃度，DNA濃度為30～50 ng/mL，A260/A280值為1.6～2.0，DNA凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2 多重?zé)晒釶CR法HPA分型檢測：從冰箱中取出HPA主反應(yīng)液和滅菌水，平衡至室溫（20～25℃）混勻后備用。每一個樣本需同時進行6管獨立的實時熒光PCR反應(yīng)。按每個反應(yīng)孔HPA主反應(yīng)液3 μL、HPA酶混合液0.4 μL、滅菌水12.6 μL配置混合母液，每個反應(yīng)孔中加入16 μL混合母液；每個反應(yīng)孔中加入2 μL對應(yīng)樣本符合濃度要求的DNA，每塊反應(yīng)板中H7-H12反應(yīng)孔加入試劑盒自帶的陽性對照樣本2 μL，吹打混勻后，貼上光學(xué)封膜，短暫離心后，放入熒光定量PCR儀中；根據(jù)設(shè)定好的循環(huán)參數(shù)，運行7500熒光定量PCR儀；實驗結(jié)束后，取出反應(yīng)板，讀取數(shù)據(jù)。

3.3 多重?zé)晒釶CR法HPA分型檢測結(jié)果分析

3.3.1 ABI7500熒光定量PCR儀：根據(jù)HPA亞型探針熒光標識表，擴增曲線正常且Ct＜32，判斷相應(yīng)的HPA亞型為陽性；無擴增曲線升起或Ct≥32，判斷相應(yīng)的HPA亞型為陰性；擴增曲線異常，重新檢測。

3.3.2 軟件分析：將ABI7500熒光定量PCR儀的原始結(jié)果文件輸出為Excel文件，并將其導(dǎo)入判讀軟件中，軟件直接分析出待檢樣本HPA基因型別。

3.4 PCR-SBT法HPA基因測序

3.4.1 擴增反應(yīng)：從冰箱中取出HPA擴增引物板及按比例稀釋后的dNTP-Buffer溶液，每人份取上述稀釋液80 μL置于干凈EP管中，加入8 μL DNA進行配制，振蕩混勻數(shù)秒；每人份每孔加入10 μL上述混合液于擴增引物板中，封板膜覆上擴增引物板，短暫離心后使用PCR儀進行PCR 反應(yīng)。

3.4.2 擴增產(chǎn)物檢測及純化：取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，使用2%瓊脂糖凝膠，140-150V電泳10分鐘，進行產(chǎn)物電泳驗證；每孔檢測到特異性擴增產(chǎn)物后，在剩余的5 μL擴增產(chǎn)物中加入0.5 μL ExoSAP，蓋好封板膜，震蕩混勻后短暫離心至管底，使用PCR儀進行ExoSAP純化反應(yīng)。

3.4.3 測序產(chǎn)物純化：在測序引物板中每孔加入BigDye Buffer稀釋液后短暫離心，每孔加入1 μL ExoSAP純化產(chǎn)物。封覆板膜，震蕩混勻后，短暫離心，使用PCR儀進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束向引物板每孔的測序產(chǎn)物中加入2 μL PPT Buffer，短暫離心后，向每管加入40 μL無水乙醇，充分震蕩至少1 min，室溫避光靜置15 min，離心倒置后，再重復(fù)一次。室溫避光放置引物板直至酒精揮發(fā)干凈，向每孔中加入10 μLHi-Di Formamide溶解DNA。蓋好封板膜，短暫離心，于PCR擴增儀中進行測序產(chǎn)物變性反應(yīng)。反應(yīng)完成后上測序儀進行數(shù)據(jù)收集。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 將實驗數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算公式如下，基因頻率=陽性數(shù)（aa或ab或bb）/總?cè)藬?shù)，a基因頻率=（aa+ab/2）/總?cè)藬?shù)，b基因頻率=（bb+ab/2）/總?cè)藬?shù)，利用χ2檢驗是否符合Hardy-Weinberg平衡。

結(jié) 果

1 多重?zé)晒夥椒℉PA分型檢測，樣本檢測的熒光曲線在ABI7500熒光定量PCR儀上顯示如圖1所示；將ABI7500熒光定量PCR儀的原始結(jié)果文件導(dǎo)入判讀軟件后，分析出HPA基因型別，判讀結(jié)果示例如圖2所示；安徽合肥地區(qū)1181份單采血小板捐獻者血樣多重?zé)晒釶CR法HPA1-6，10，15，21基因型分布及頻率如表1中所示，其中HPA-10未檢出b等位基因，HPA1-6，15，21系統(tǒng)中a等位基因頻率均高于b等位基因頻率。HPA-3和HPA-15的雜合度較高。

表1 安徽合肥地區(qū)單采血小板捐獻者HPA1-6，10，15，21基因型分布及頻率

圖1 ABI7500熒光定量PCR儀熒光曲線示例

圖2 檢測數(shù)據(jù)軟件判讀示例

2 選取的22名捐獻者血樣使用SBT方法進行HPA分型檢測，以便于對多重?zé)晒釶CR法HPA分型結(jié)果的驗證；其中部分HPA分型檢測結(jié)果如圖3所示，將22例樣本使用多重?zé)晒釶CR法與SBT方法檢測的HPA1-6，10，15，21基因型結(jié)果進行了對比，22份樣本使用SBT方法檢測的HPA1-6，10，15，21基因型結(jié)果與使用多重?zé)晒釶CR方法檢測的結(jié)果相同，其中包含了HPA-1ab、HPA-4ab、HPA-5ab、HPA-6ab、HPA-21ab等低頻抗原樣本，兩種方法檢測的22份樣本結(jié)果完全一致。

圖3 部分HPA基因分型檢測結(jié)果示例

3 安徽合肥地區(qū)1 181份單采血小板捐獻者HPA基因頻率與文獻中國內(nèi)其他地區(qū)人群的HPA基因頻率比較如表2中所示，其中HPA-21基因型檢測的較少，未進行比較。

表2 安徽合肥地區(qū)單采血小板捐獻者HPA基因頻率與國內(nèi)其他地區(qū)比較

討 論

人類血小板抗原（Humman Platelet Antigen，HPA）是位于血小板膜糖蛋白上的抗原表位，是血小板本身固有的抗原，它由血小板特有的抗原決定簇組成。目前已發(fā)現(xiàn)35種HPA抗原[9]，按發(fā)現(xiàn)時間順序命名為HPA-1到HPA-29；其中HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5 和HPA-15是雙等位基因抗原系統(tǒng)[10]，其他23種抗原是單個低頻抗原。在共顯性雙等位基因的遺傳系統(tǒng)中，a表示基因頻率大于50%的等位基因，b表示基因頻率小于50%的另一等位基因，字母w表示兩個對偶HPA抗原只檢測到一種相應(yīng)的抗體[11]。

目前多種HPA基因分型的方法中使用較多的有序列特異引物聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR-SSP）和直接測序分型（SBT）方法[6]。PCR-SSP方法檢測成本相對低，儀器設(shè)備要求低；但需要電泳步驟，操作繁瑣，相對耗時；結(jié)果無法自動獲得，帶有主觀性，準確度有待提高。直接測序分型（SBT）方法準確度高，是HPA基因分型的金標準，但檢測成本和儀器設(shè)備要求較高，操作步驟繁瑣。本研究中安徽合肥地區(qū)1181例單采血小板捐獻者血樣的HPA基因分型檢測采用的是多重?zé)晒釶CR方法。其檢測原理是采用實時熒光PCR結(jié)合Taqman探針技術(shù)對HPA基因進行定性分型檢測。Taqman熒光PCR法其引物設(shè)計方法相似，同時增加若干條亞型特異性探針。在PCR擴增過程中，當(dāng)探針完整時，不發(fā)出熒光信號。引物延伸時，與模板結(jié)合的探針被Taq酶（5'→3'外切核酸酶活性）切斷，報告基團與淬滅基團分離，產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號自動繪制出實時擴增曲線，從而實現(xiàn)對基因的分型檢測。在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對或以上引物和相應(yīng)的兩條或多條探針，同時擴增出兩個或者兩個以上核酸片段，鑒定兩種或兩種以上的基因型存在與否。使用了FAM（520 nm）、HEX（560 nm）、ROX（610 nm）、CY5（670 nm）四種熒光標記的探針，分布于同一反應(yīng)孔，一個反應(yīng)即可檢測4種HPA基因型別。如反應(yīng)孔1，F(xiàn)AM熒光探針標識HPA-1a基因型，HEX熒光探針標識HPA-2a基因型，ROX熒光探針標識HPA-3a基因型，反應(yīng)孔2，F(xiàn)AM熒光探針標識HPA-1b基因型，HEX熒光探針標識HPA-2b基因型，ROX熒光探針標識HPA-3b基因型，每孔CY5熒光探針標識內(nèi)標，其他反應(yīng)孔同理，因此可以實現(xiàn)每孔多重反應(yīng)，盡可能的縮短了實驗操作時間。相對于以往的HPA分型檢測使用較多的PCR-SSP方法，操作簡便，不需要電泳步驟，實驗時間較短，適合血液中心大批量、快速檢測血小板捐獻者血樣HPA基因型，同時軟件分析得出檢測結(jié)果，減少人為判定的主觀性，保證結(jié)果客觀有效。

本實驗室為進一步驗證多重?zé)晒釶CR方法檢測結(jié)果的準確性，選取22份樣本DNA使用SBT的方法進行驗證。22份樣本中包含了低頻抗原樣本。通過兩種方法檢測結(jié)果來看，一致性較好。從而驗證了多重?zé)晒釶CR方法檢測結(jié)果的準確性。

本實驗中檢測的1 181份單采血小板捐獻者血樣的HPA1-6，10，15，21頻率結(jié)果如表1，其中HPA-2、HPA-3、HPA-15最具有多態(tài)性，與國內(nèi)外文獻中報道較一致[12]。HPA基因型多態(tài)性主要是由于相應(yīng)血小板膜糖蛋白結(jié)構(gòu)基因中的單核苷酸多態(tài)性引起[9]，從而導(dǎo)致相應(yīng)位置的單個氨基酸變異[12]。HPA-3位于GPⅡb上，其單核苷酸多態(tài)性是由于編碼GPⅡb的cDNA上第2 621位T→G取代，導(dǎo)致GPⅡb第843位異亮氨酸由絲氨酸所替代。HPA-15是雙等位共顯性遺傳系統(tǒng)，相應(yīng)的抗原由CD109蛋白攜帶。編碼HPA-15a和15b抗原的等位基因，是由CD109cDNA編碼區(qū)2108位C→A單核苷酸取代而產(chǎn)生，導(dǎo)致CD109蛋白的第682位絲氨酸由絡(luò)氨酸所替代。本地區(qū)的HPA基因頻率與國內(nèi)一些其他地區(qū)的HPA基因頻率比較情況如表2中所示，從表中內(nèi)容可以發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)血小板捐獻者人群的HPA基因型分布有著本地區(qū)的特點。據(jù)文獻報道HPA-4ab的基因頻率較低[13]，本實驗中發(fā)現(xiàn)了3例HPA-4ab的單采血小板捐獻者，通過查閱文獻[5-6]，比較得出本地區(qū)人群的HPA-4ab基因頻率高于河源、黑龍江、長沙等地區(qū)，但低于北京、山東等地區(qū)[4，7]，考慮與不同地區(qū)的人群分布有關(guān)，HPA-4ab基因頻率與國內(nèi)其他地區(qū)有一定的差異，有著本地區(qū)的HPA基因型分布特點。本次實驗檢測了HPA-21的基因型別，HPA-21位于GPⅢa上，其單核苷酸多態(tài)性是由于編碼GPⅢa的cDNA上第1 960位G突變?yōu)锳取代，導(dǎo)致氨基酸改變，本地區(qū)基因頻率分別為21aa：0.985 2，21ab：0.0148 3，未檢測出HPA-21bb樣本。為國內(nèi)人群的HPA-21基因型分布提供一定的參考數(shù)據(jù)。從表2中可以看出本次實驗中得出的HPA-1ab、HPA-2ab、HPA-6ab等基因頻率與文獻報道[3]的安徽地區(qū)的基因頻率有一定的差異性。分析原因，本實驗采用多重?zé)晒釶CR方法檢測樣本，是否與使用SSP-PCR方法檢測HPA-1ab、HPA-2ab、HPA-6ab等低頻基因型樣本，檢測結(jié)果存在一定的差異性，兩種檢測方法結(jié)果的差異性有待探討。

隨著血液精準輸注的觀念深入人心，為保障患者的輸血安全，最大提高患者輸注血液的療效，現(xiàn)今血液的配合性輸注不僅局限于ABO血型相配合，特別是一些血液病患者或需多次輸注血液制品的患者，與供者的HLA、HPA型別的配合性輸注，已被廣泛認可[11]。據(jù)報道[12]，導(dǎo)致PTR和NAITP的發(fā)生主要由血小板特異性抗原HPA-1a、HPA-1b、HPA-4a、HPA-3a、HPA-3b、HPA-2b等引起；新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜（NAITP）主要由HPA-4a、HPA-3a等抗原造成。因此為患者找到配合性型別的血小板捐獻者，輸注HPA基因型配合性的的血小板制品使患者的治療有效率得到顯著提升[14]。根據(jù)以上實驗結(jié)果分析，本地區(qū)單采血小板人群的HPA的基因分布頻率有著本區(qū)域的特點。本血液中心設(shè)立在安徽省省會城市，全省的單采血小板采集量和供應(yīng)量均居全省首位，因此建立合適庫容的血小板捐獻者資料庫，為患者提供HLA和HPA基因型配合的血小板血液制品有著重要的意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突