羅開(kāi)云 王淑君 毛平平 孫楊子 齊清 欒建鳳

富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是自體新鮮全血經(jīng)離心后獲得的血小板濃縮物，其血小板含量是全血的5倍以上[1]，激活PRP釋放高濃度的生長(zhǎng)因子和抗炎因子[2]，包括血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）等[3-4]，這些生長(zhǎng)因子可以持續(xù)釋放約7天，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化，參與創(chuàng)傷部位血運(yùn)重建，組織再生等復(fù)雜的愈合過(guò)程[5-6]。近年來(lái)PRP受到眾多學(xué)科的青睞，廣泛用于關(guān)節(jié)炎[7]、骨修復(fù)[8]、糖尿病足[9]和面部年輕化、痤瘡、禿發(fā)[10]等治療。但血小板的保存時(shí)間較短，在20～24℃振蕩條件下僅為5天[11]，目前PRP多是即制備即使用，且常溫條件下容易發(fā)生細(xì)菌污染，大大限制了其應(yīng)用價(jià)值[12]。有學(xué)者嘗試?yán)洳兀?℃）或者冷凍（-80℃或-196℃）保存血小板，以降低細(xì)菌污染，但也不可避免地造成血小板損傷[13-14]。本文探討不同的保存方法對(duì)PRP性能的影響，以期探索更具優(yōu)勢(shì)的保存方式。

資料與方法

1 主要儀器與材料

1.1 儀器：冷凍干燥機(jī)（上海愛(ài)朗儀器有限公司，型號(hào)：FDU-1200）、臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf公司，型號(hào)：5415R）、酶標(biāo)儀（Hamilton公司，型號(hào)：FAME M8）、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（Sysmex公司，型號(hào)：XE2100）、-80℃超低溫冰箱（Haier公司，型號(hào)：DW-86L628）、電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)：DK-8D）、反滲透純水設(shè)備（南京峻朗科技有限公司，純晶牌）等。

1.2 材料：TGF-β1 ELISA試劑盒（聯(lián)科生物，批號(hào)：A98110121）、VEGF ELISA試劑盒（聯(lián)科生物，批號(hào)：A18310135）、PDGF-BB ELISA試劑盒（聯(lián)科生物，批號(hào)：A913700823）、10%葡萄糖酸鈣注射液（雙鶴藥業(yè)，批號(hào)：20110536）、300 mL一次性采血袋（Fresenius Kabi，批號(hào)：85PA06FE00）。

2 方法

2.1 PRP的制備：招募20位健康獻(xiàn)血者并獲得倫理審批及知情同意后，采集300 mL全血，利用密度梯度三次離心法制備PRP。首先將全血以離心力1 200 g離心10 min，分離出血漿；再將血漿以213 g離心8 min，分離上層血漿；第三次以4 650 g快速離心血漿6 min，血小板沉積底部，去除上層貧血小板血漿，剩余部分即為PRP[15]。20份PRP各取1 mL送檢血常規(guī)，進(jìn)行血小板及殘留紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，另外各留取10 mL作實(shí)驗(yàn)用。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：每份PRP分為5組，每組2 mL，分別為新鮮PRP組（PRP組）、冷凍后PRP激活組（F-Ca PRP組）、激活后PRP冷凍組（Ca-F PRP組）、凍干PRP激活組（FD-Ca PRP組）和激活后PRP凍干組（Ca-FD PRP組）。

2.2.2 PRP保存處理及檢測(cè)留樣：PRP（n=20）：本組每份取1 mL PRP，10 000 g離心10 min取上清進(jìn)行三種生長(zhǎng)因子的檢測(cè)，另取1 mL加入200 μL的10%葡萄糖酸鈣注射液激活，記錄PRP成膠時(shí)間。

F-Ca PRP（n=20）：本組每份取1 mL PRP放置-80℃低溫冰箱冷凍保存，4周后取出，置37℃水浴復(fù)融后，加入200 μL的10%葡萄糖酸鈣注射液激活，記錄PRP成膠時(shí)間后，10 000 g離心10 min取上清進(jìn)行檢測(cè)。

Ca-F PRP（n=20）：本組每份取1 mL PRP加入200 μL的10%葡萄糖酸鈣注射液激活成膠后即10 000 g離心10 min取上清，置-80℃低溫冰箱冷凍保存4周后，37℃水浴復(fù)融進(jìn)行檢測(cè)。

FD-Ca PRP（n=20）：本組每份取1 mL PRP樣本，置-80℃低溫冰箱冷凍過(guò)夜后，凍干機(jī)預(yù)降溫至-46℃，樣本移至凍干機(jī)真空干燥，保持真空度＜133 mbar，干燥8 h后取出，密封于室溫干燥保存4周后，加入純水至1 mL復(fù)水[16]，再加入200 μL的10%葡萄糖酸鈣注射液激活，記錄PRP成膠時(shí)間后即10 000 g離心10 min取上清進(jìn)行檢測(cè)。

Ca-FD PRP（n=20）：本組每份取1 mL PRP，加入200 μL的10%葡萄糖酸鈣激活成膠后即10 000 g離心10 min取上清，記錄上清液體積，置-80℃低溫冰箱冷凍過(guò)夜后，凍干機(jī)預(yù)降溫至-46℃，樣本移至凍干機(jī)真空干燥，保持真空度＜133 mbar，干燥8 h后取出，密封于室溫干燥保存4周后，加入與凍干前該樣本等體積純水復(fù)水后進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3 生長(zhǎng)因子濃度的檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)生長(zhǎng)因子TGF-β1、VEGF和PDGF-BB含量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)組間比較，TGF-β1、VEGF、PDGF-BB和成膠時(shí)間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性，進(jìn)一步采用Tukey法分析結(jié)果，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血小板計(jì)數(shù)及殘留紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 經(jīng)密度梯度三次離心法制備的PRP中血小板濃度為（1 031±150.1）×109/L，約為全血的4～5倍。殘留紅細(xì)胞數(shù)為（0.042±0.031）×1012/L。

2 成膠時(shí)間 因Ca-F PRP組和Ca-FD PRP組是新鮮PRP經(jīng)鈣激活成膠后留取的上清液再進(jìn)行冷凍或凍干，而復(fù)水復(fù)融后的上清液不再形成血小板膠，故只記錄了PRP組、F-Ca PRP組和FD-Ca PRP組的成膠時(shí)間（見(jiàn)表1）。F-Ca PRP組和FD-Ca PRP組的成膠時(shí)間均較新鮮PRP組短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 PRP激活組的成膠時(shí)間（n=20）

3 生長(zhǎng)因子濃度分析 經(jīng)檢測(cè)TGF-β1、VEGF和PDGF-BB的含量詳見(jiàn)表2。分別將各組結(jié)果與PRP組進(jìn)行比較，其中TGF-β1含量：F-Ca PRP組、Ca-F PRP組和Ca-FD PRP組與PRP組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），而FD-Ca PRP組高于PRP組（P＞0.05）；VEGF含量：F-Ca PRP組和Ca-FD PRP組與PRP組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），而Ca-F PRP組和FD-Ca PRP組均高于PRP組且FD-Ca PRP組差異明顯（P＜0.05）；PDGF-BB含量：F-Ca PRP組、Ca-FD PRP組均明顯低于PRP組（P＜0.05），F(xiàn)D-Ca PRP組與PRP組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），而Ca-F PRP組高于PRP組（P＜0.05）。

表2 生長(zhǎng)因子TGF-β1、VEGF 和PDGF-BB的含量（n=20）

討 論

冰凍狀態(tài)時(shí)血小板基本處于休眠狀態(tài)且無(wú)細(xì)菌污染及繁殖，有利于血小板的長(zhǎng)期有效保存[17-18]，解決了因保存期短而造成資源浪費(fèi)、需反復(fù)采集制備PRP的問(wèn)題。本研究采用了三次離心法制備PRP，減少紅細(xì)胞殘留，更適合低溫冷藏、冷凍和凍干保存[15]。但冷凍保存需要深低溫冰箱，不利于PRP的遠(yuǎn)距離運(yùn)送。有學(xué)者研究顯示用氯化鈣激活豬PRP凍干后，室溫保存4周仍含豐富的生長(zhǎng)因子，認(rèn)為激活后凍干的PRP在使用時(shí)只需復(fù)水即可，使用更加方便[19]。

TGF-β1、VEGF和PDGF-BB是PRP中含量較高的三種生長(zhǎng)因子，我們以新鮮PRP為基礎(chǔ)對(duì)照組，分析了不同保存處理方式對(duì)PRP中上述生長(zhǎng)因子含量的影響，探討一種更加適合PRP保存并且不影響其生長(zhǎng)因子釋放的保存方式。與新鮮PRP相比，TGF-β1無(wú)論是激活后再冷凍或凍干，還是冷凍或凍干后再激活，其含量較新鮮PRP組無(wú)明顯差異；而VEGF，凍干PRP組明顯高于新鮮PRP，其他處理保存方式與新鮮PRP無(wú)明顯差異；對(duì)于PDGF-BB，凍干PRP組與新鮮PRP比較沒(méi)有明顯差異。此外，F(xiàn)D-Ca PRP組的TGF-β1和VEGF含量均為各組最高，可推測(cè)，凍干保存PRP的方法對(duì)PRP生長(zhǎng)因子濃度無(wú)明顯影響，甚至個(gè)別生長(zhǎng)因子釋放優(yōu)于其他保存形式。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示冷凍保存或凍干保存后再激活制備成富血小板膠所需時(shí)間均小于新鮮PRP的成膠時(shí)間，說(shuō)明冷凍或凍干保存對(duì)PRP形成血小板膠所需時(shí)間更短，更適合戰(zhàn)時(shí)創(chuàng)傷、臨床急救使用。相對(duì)于冷凍PRP，凍干PRP室溫即可保存，復(fù)水再使用簡(jiǎn)單快速，對(duì)PRP的長(zhǎng)期保存、多次使用更具優(yōu)勢(shì)，更利于拓展其應(yīng)用范圍。

本研究的標(biāo)本量?jī)H20份且來(lái)源于健康獻(xiàn)血者，只分析了保存4周后PRP的三種生長(zhǎng)因子含量，具有一定的局限性，冷凍或凍干對(duì)PRP的激活有無(wú)其他影響、冷凍或凍干PRP長(zhǎng)期保存效果如何等，需在今后的研究中進(jìn)一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突