陳陽

胎兒與新生兒溶血?。╤emolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是母親與胎兒紅細(xì)胞血型不合引起的同種被動(dòng)免疫性疾病。已發(fā)現(xiàn)多種紅細(xì)胞血型系統(tǒng)的抗體可引起HDFN，其中ABO血型不合者多見，其次為Rh血型不合，MNS、Kell及Kidd等血型少見，Rh系統(tǒng)抗-D抗體所致的HDFN最為嚴(yán)重。在我國，RhD陰性人群的比例約為0.3%～0.5%，每年約有一萬余例RhD陰性孕產(chǎn)婦，是個(gè)不容忽視的群體[1-2]。筆者對(duì)596例孕婦夫婦進(jìn)行ABO血型及RhD抗原檢查，孕婦進(jìn)行抗體篩選及鑒定。為了解RhD陰性孕婦產(chǎn)生抗-D抗體發(fā)生同種免疫的狀況，為臨床診斷、治療Rh新生兒溶血病提供理論和實(shí)踐依據(jù)，初步探討RhD陰性孕婦個(gè)體的分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的特征，為指導(dǎo)RhD陰性孕婦進(jìn)行RhD免疫球蛋白干預(yù)治療提供初步的理論依據(jù)。

材料與方法

1 研究對(duì)象 以2017年1月～2020年12月在遼寧省血液中心進(jìn)行新生兒溶血病產(chǎn)前檢查的596例孕婦為研究對(duì)象。這項(xiàng)研究獲得遼寧省血液中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 主要試劑及儀器 抗-A、-B血型定型試劑、人ABO血型反定型紅細(xì)胞、抗人球蛋白試劑、篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞、抗-C、抗-c、抗-E和抗-e試劑均為上海市血液中心生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；IgM抗-D試劑（Seraclone，Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestrabe 163303 Dreich，Germany）；TIANamp Blood DNA Kit、GoTaq? Green Master Mix（Promega公司）、DEL特異性引物序列由TaKaRa公司合成、天津秀鵬人類紅細(xì)胞RHD血型部分D基因檢測(cè)試劑盒。凝膠成像儀（Enduro GDS Touch）。

3 方法

3.1 ABO血型及RhD抗原檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)室檢查方案符合中國輸血協(xié)會(huì)免疫血液學(xué)專業(yè)委員會(huì)專家組制定的《胎兒新生兒溶血病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)專家共識(shí)》[3]。所有孕婦在妊娠8～12周建檔進(jìn)行ABO和RhD血型鑒定，紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩查?？贵w篩查陽性進(jìn)行抗體鑒定。ABO正反定型和RhD抗原檢測(cè)按照文獻(xiàn)[4]試管法操作。IgM抗-D試劑檢測(cè)陰性樣本，檢測(cè)孕婦RhC、c、E、e抗原。

3.2 抗體篩選及鑒定：抗體篩選方法見文獻(xiàn)[4]，對(duì)抗體篩選陽性個(gè)體用10個(gè)O型譜細(xì)胞（上海市血液中心生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）進(jìn)行抗體鑒定，抗-D效價(jià)檢測(cè)采用間接抗人球蛋白法?？贵w檢測(cè)時(shí)機(jī)與頻次按照中國醫(yī)師協(xié)會(huì)輸血科醫(yī)師分會(huì)發(fā)布《新生兒溶血病免疫血液學(xué)試驗(yàn)推薦方案》[5]及2017年專家協(xié)作組《RhD抗原陰性孕產(chǎn)婦血液安全管理專家共識(shí)》[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 亞洲型DEL（RHD*01EL.01）檢測(cè)：DEL特異性引物序列[7]，特異擴(kuò)增RHD*01EL.01等位基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為867 bp；人生長(zhǎng)激素基因429 bp的引物作為內(nèi)對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s、58℃退火30 s和72℃延伸50 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝胺電泳，拍照觀察結(jié)果，并進(jìn)行RHD血型部分D基因檢測(cè)。

3.4 Rh免疫球蛋白（RhIG）用藥指征及注射時(shí)間：RhD陰性孕婦，丈夫?yàn)镽hD陽性時(shí)，胎兒就有可能是RhD抗原陽性，孕婦有致敏的風(fēng)險(xiǎn)，成為RhIG預(yù)防治療的候選人[8]。未產(chǎn)生抗-D的RhD陰性孕婦注射抗-D免疫球蛋白采用28周的單劑量1 500 IU方案或28周和34周的雙劑量各500 IU方案均可，同時(shí)監(jiān)測(cè)注射后抗-D水平；分娩后新生兒臍血檢測(cè)RhD陽性，產(chǎn)婦產(chǎn)后72 h內(nèi)再注射1次≥500 IU 抗-D免疫球蛋白，越早越好[9]。產(chǎn)婦做胎母輸血綜合征（fetomaternal hemorrhage，F(xiàn)MH）檢測(cè)，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果決定是否追加注射；RhD陰性孕婦孕期行絨膜絨毛取樣、羊水穿刺、胎兒侵入性操作、創(chuàng)傷或者陰道流血后，也應(yīng)于72 h內(nèi)完成肌內(nèi)注射。對(duì)孕產(chǎn)婦履行告知可能風(fēng)險(xiǎn)，知情同意后，醫(yī)生開具處方進(jìn)行注射。

3.5 胎兒及新生兒溶血病監(jiān)測(cè)：產(chǎn)生抗-D抗體的孕婦于胎兒娩出后進(jìn)行新生兒血樣或胎兒娩出后采集臍帶血進(jìn)行血型、Hb、膽紅素測(cè)定、直抗、游離抗體試驗(yàn)、釋放試驗(yàn)。

結(jié) 果

1 ABO血型及RhD抗原檢測(cè)結(jié)果 596例孕婦中，O型542例，A型21例，B型25例，AB型8例；RhD陽性526例，70例IgM抗-D檢測(cè)為陰性。

2 抗體篩選及鑒定結(jié)果 70例血清學(xué)RhD陰性孕婦中，有43例為初次妊娠，27例為妊娠次數(shù)在兩次及以上。初次妊娠孕婦均未產(chǎn)生抗體，27例多次妊娠史孕婦中，6例產(chǎn)生抗-D抗體，產(chǎn)生抗體比例為8.57%，6例產(chǎn)生抗-D抗體孕婦均有妊娠史、孕產(chǎn)史、無輸血史。具體檢測(cè)結(jié)果見表1。

3 亞洲型DEL（RHD*01EL.01）檢測(cè)結(jié)果 70例RhD抗原陰性孕婦采用PCR-SSP方法檢測(cè)亞洲型DEL（RHD*01EL.01），即檢測(cè)RHD*1227A等位基因。其中含有RHD*1227A等位基因18例，RHD*1227A等位基因陰性52例。6例產(chǎn)生抗-D抗體孕婦均未檢測(cè)到RHD*1227A等位基因。18例含有RHD*1227A等位基因樣本中抽取4例采用天津秀鵬人類紅細(xì)胞RHD血型部分D基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果全部相符，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 亞洲型DEL（RHD*01EL.01）基因型檢測(cè)結(jié)果

4 RhIG治療 64名未產(chǎn)生抗-D抗體RhD陰性孕婦，其丈夫均為RhD陽性。初次妊娠37名，多次妊娠27名，母兒Rh血型不合58名孕婦在孕28周、34周、分娩時(shí)復(fù)查抗-D抗體，未致敏的妊娠，采用28周的單劑量1 500 IU方案或28周和34周的雙劑量各500 IU方案均可，同時(shí)監(jiān)測(cè)注射后抗-D水平；分娩后新生兒臍血檢測(cè)RhD陽性，產(chǎn)婦產(chǎn)后72 h內(nèi)再注射1次≥ 500 IU抗-D免疫球蛋白。28周孕前檢查出抗-D致敏的6名孕婦，也使用抗-D免疫球蛋白制劑1 500 IU以阻斷抗-D免疫應(yīng)答發(fā)生。

5 胎兒及新生兒溶血病檢測(cè) 6例RhD陰性孕婦產(chǎn)生胎兒D血型均為陽性，直抗陽性，其中5名胎兒未發(fā)生HDFN。樣本1孕婦抗-D效價(jià)64，胎兒臍帶血游離試驗(yàn)和釋放試驗(yàn)陽性，證實(shí)抗-D引起新生兒溶血病。胎兒進(jìn)行換血治療，效果良好。

討 論

本研究70例RhD抗原陰性樣本中，多次孕產(chǎn)史為RhD陰性女性對(duì)D抗原致敏的主要誘因，RhD陰性孕婦中6例產(chǎn)生抗-D抗體，8.57%孕產(chǎn)婦對(duì)D抗原致敏并產(chǎn)生IgG抗-D。6例產(chǎn)生抗-D抗體孕婦都排除亞洲型DEL，與我們之前調(diào)查結(jié)果一致，即產(chǎn)生抗-D抗體的被檢者都不是DEL型，DEL型的被檢者未產(chǎn)生抗-D抗體[10-11]。因胎齡8周左右的胎兒紅細(xì)胞上即可檢出Rh抗原，孕婦的同種免疫常發(fā)生在第2胎及以后，孕婦在生育第1胎時(shí)，胎兒血進(jìn)入母體，造成初次免疫，在二胎時(shí)，胎兒血液再次進(jìn)入母體，刺激母體免疫系統(tǒng)的回憶反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗-D抗體。所以多次妊娠和生育RhD陽性胎兒，會(huì)刺激孕婦產(chǎn)生抗-D抗體。6例產(chǎn)生抗-D抗體孕婦中，5例為二胎，1例妊娠5次，均無輸血史，因此6名孕婦產(chǎn)生抗-D抗體與多次妊娠和生育RhD陽性胎兒有關(guān)。6例產(chǎn)生抗-D抗體孕婦，孕12周后對(duì)抗-D抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)合孕婦抗體效價(jià)和胎兒大腦中動(dòng)脈的超聲結(jié)果評(píng)估胎兒的貧血狀況?？谷饲虻鞍祝ˋHG）方法的抗-D臨界值為16，低于此效價(jià)時(shí)認(rèn)為HDFN和胎兒水腫發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較低且不需要進(jìn)行侵入性干預(yù)。

血型抗體特異性與HDFN發(fā)生有一定程度相關(guān)性，其中母體中存在抗-D極易引起HDFN的發(fā)生甚至胎兒或新生兒死亡[12]。RhD陰性孕婦產(chǎn)前檢測(cè)到抗-D抗體，即提示新生兒面臨發(fā)生HDFN的風(fēng)險(xiǎn)。在我國對(duì)RhD血型不合所致的HDFN孕婦主要采取監(jiān)測(cè)和支持療法，缺乏特異性的治療手段。RhD血型不合所致的HDFN的預(yù)防重點(diǎn)在于阻斷母體首次建立抗-D免疫應(yīng)答過程。歐洲國家通過注射RhIG治療制劑，顯著降低了RhD血型不合所致的HDFN發(fā)病率[13-15]。美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)推薦在妊娠28周進(jìn)行RhIG治療，產(chǎn)前RhIG治療可以將同種免疫概率降至0.1%，而產(chǎn)后RhIG治療僅可將同種免疫概率降至1.5%[8]。此外，在羊膜穿刺術(shù)、臍帶穿刺術(shù)、流產(chǎn)或腹部創(chuàng)傷后均應(yīng)進(jìn)行RhIG治療。RhD陰性孕婦推薦孕婦外周血游離胎兒DNA（cell-free fetal DNA，cff-DNA）檢測(cè)以確定胎兒RhD血型基因型，針對(duì)性的進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)防抗-D免疫球蛋白注射，避免不必要用藥，未產(chǎn)生抗-D抗體的孕婦進(jìn)行cff-DNA檢測(cè)，可減少孕婦產(chǎn)前檢查頻次[16]。

HDFN以胎兒及新生兒溶血為主要病理過程，以貧血和新生兒黃疸為主要臨床表現(xiàn)的圍產(chǎn)期常見疾病。溶血程度與效價(jià)值呈正相關(guān)，使之產(chǎn)生不同程度的溶血，可引起胎兒貧血、水腫、流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)[17]。對(duì)于Rh-HDFN，近20年來抗-D的免疫球蛋白的應(yīng)用有很大進(jìn)展，可使發(fā)病率和病死率顯著下降，母親的致敏率可從16%下降到2%，而實(shí)施28周預(yù)防后，致敏率降低到約0.37%；HDFN導(dǎo)致的新生兒死亡率從46/100 000降為1.6/100 000[2]。另外胎兒Rh血型檢測(cè)對(duì)預(yù)防HDFN發(fā)生具有重要指導(dǎo)意義。如果胎兒為RhD陰性，則不必使用RhIG治療和產(chǎn)前抗體監(jiān)測(cè)。應(yīng)用DNA技術(shù)無創(chuàng)檢測(cè)胎兒Rh血型是產(chǎn)前檢測(cè)的一項(xiàng)可靠技術(shù)。RhD陰性孕婦妊娠期發(fā)生RhD同種免疫主要采取孕婦血漿置換、胎兒臍靜脈輸血及注射RhIG等，產(chǎn)后對(duì)嬰兒主要采用嬰兒換血或者光療法等治療方案。另外加強(qiáng)圍產(chǎn)期宣教和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)孕婦抗-D效價(jià)，可有效防治HDFN和產(chǎn)后出血，避免同種抗體引起新生兒殘疾，提高圍產(chǎn)期保健質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突