潘春磊，王延鋒，盛春鴿，王金賀，張 鵬，于海洋

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157000）

黑木耳（Auricularia heimuer） 又名光木耳、云耳，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota） 傘菌綱（A－garicomycotina） 木耳目 （Agaricomycetes） 木耳科（Auriculariales） 木耳屬 （Auricularia）[1]。黑木耳營(yíng)養(yǎng)豐富，子實(shí)體中含有蛋白質(zhì)、膳食纖維、多糖、氨基酸、黃酮、多酚等物質(zhì)[2-5]，微量元素中尤其以鐵的含量最為豐富[6]，被譽(yù)為食品中的“含鐵冠軍”。黑木耳人工栽培起源于我國(guó)，在我國(guó)廣泛栽培，目前是我國(guó)繼平菇（Pleurotus ostreatus）、香菇（Lentinus edodes） 后的第三大栽培食用菌[7-9]，我國(guó)也是世界黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展最好的國(guó)家，據(jù)悉，我國(guó)的黑木耳產(chǎn)能高達(dá)世界總產(chǎn)能的90%以上[10]。

黑木耳產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致其品種數(shù)量也急速增加，然而由于食用菌菌種和種質(zhì)資源的特殊性，導(dǎo)致市場(chǎng)上存在著大量同物異名的現(xiàn)象，極大地限制了食用菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)分析就顯得尤為重要。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)方面應(yīng)用極為廣泛[11]，卜海東等[12]利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合表型形狀構(gòu)建了寒地梨資源核心種質(zhì)，李慧等[13]基于SSR標(biāo)記構(gòu)建了平菇栽培品種核心樣本。徐安然等[14]構(gòu)建了木耳部分種質(zhì)資源的SSR分子身份證。王新新等[15]通過(guò)SSR構(gòu)建了29份雙孢蘑菇菌株的分子身份證，為雙孢蘑菇種質(zhì)資源的研究評(píng)價(jià)提供了參考。

以農(nóng)藝性狀為基礎(chǔ)的遺傳多樣性研究在植物上得到了廣泛的應(yīng)用[16]。張向前等[17]對(duì)多個(gè)燕麥的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查；陳影等[18]對(duì)木耳進(jìn)行了以農(nóng)藝性狀為主的多樣性分析，研究燕麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性；常艷等[19]對(duì)糙皮側(cè)耳的農(nóng)藝性狀進(jìn)行研究，探討各個(gè)性狀間的相關(guān)性；盛春鴿等[20]以平菇農(nóng)藝性狀為基礎(chǔ)，分析了外引群體和國(guó)內(nèi)群體的遺傳差異。以表型為基礎(chǔ)的遺傳多樣性研究國(guó)外也有個(gè)案，Horvath等[21]通過(guò)對(duì)梨資源的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，研究其表型多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，Szamosi等[22]對(duì)甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了農(nóng)藝性狀多樣性分析。

以保藏在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院的59株主栽黑木耳菌株為試驗(yàn)材料，通過(guò)分子鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查等方法，對(duì)這些菌株的遺傳多樣性進(jìn)行了客觀的評(píng)價(jià)，同時(shí)也為黑木耳種質(zhì)資源研究提供了一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料黑木耳菌株59株，庫(kù)存編號(hào)AU60～AU96、AU106～AU127，保藏在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院食用菌研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試培養(yǎng)基

1）馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）。

2） 原種和栽培種培養(yǎng)基：木屑78%、麥麩10%、稻糠10%、石灰1%、石膏1%，含水量65%。

1.2.2 全基因組DNA的提取

菌絲DNA的提取使用植物基因組DNA提取試劑盒DP305-03，購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2.3 SSR引物、PCR反應(yīng)體系及數(shù)據(jù)處理

SSR引物、PCR反應(yīng)體系及數(shù)據(jù)處理方法參考徐安然等[10]的研究結(jié)果。引物詳情見(jiàn)表1。

表1 引物名稱及序列Tab.1 Primer name and primer sequence

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：dNTPs 2 μL（2.5 mmol·L-1）、引物0.2 μL～0.3 μL（0.2 mmol·L-1）、10×Ex Taq PCR buffer 2 μL、Ex Taq 0.1 μL（5 U·μL-1）、DNA模板 0.4 μL～0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃～60℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)齊10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 表型試驗(yàn)設(shè)計(jì)及出耳管理

試驗(yàn)于2017年～2019年3年春季在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院食用菌示范園區(qū)內(nèi)完成，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60袋。黑木耳栽培采用全光地?cái)[模式，集中開(kāi)口、集中催芽、集中出耳，割口方式為“Y”字型口。栽培期間注意通風(fēng)和保持濕度，防止雜菌滋生，特別在耳芽形成后，既要保證濕度又要保證氧氣充足。子實(shí)體生長(zhǎng)期時(shí)，采用“干干濕濕”交替管理方法，直至木耳成熟，進(jìn)行采摘。

1.2.5 農(nóng)藝性狀測(cè)定

供試菌株農(nóng)藝性狀指標(biāo)和測(cè)定方法參考陳影等[23]的部分指標(biāo)和方法，詳見(jiàn)表2。

表2 黑木耳15個(gè)農(nóng)藝性狀的測(cè)定方法Tab.2 Value assignment of 15 agronomic traits for Auricularia heimuer

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)原基顏色等7個(gè)非數(shù)值性狀按照表2所示進(jìn)行分級(jí)賦值后再做數(shù)據(jù)分析，對(duì)其他8個(gè)數(shù)值性狀進(jìn)行質(zhì)量化處理，依照王述民[24]描述的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分為10級(jí)，1級(jí)XiX+2σ，中間每級(jí)間隔0.5σ。使用SPSS 23軟件進(jìn)行聚類(lèi)及主成分分析，聚類(lèi)時(shí)種質(zhì)間距離采用歐氏距離，類(lèi)平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA） 法。多樣性指數(shù)的計(jì)算采用Shannon-Weaver信息指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于SSR遺傳多樣性分析

基于SSR進(jìn)行遺傳多樣性分析，59個(gè)黑木耳菌株的聚類(lèi)樹(shù)狀圖見(jiàn)圖1。

圖1 59個(gè)黑木耳菌株的SSR聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.1 Dendrogram by cluster analysis based on SSR genetic similarity of 59 strains of Auricularia heimuer

如圖1所示，根據(jù)8對(duì)多態(tài)性引物的擴(kuò)增結(jié)果，59個(gè)種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)0.42～1.00，且相似性系數(shù)在0.56處將59個(gè)菌株分成4大類(lèi)，其中最大一類(lèi)樣本容量較大，共41個(gè)菌株。這可能是由于長(zhǎng)期人工選擇，導(dǎo)致了雜交育種親緣關(guān)系較近的緣故。

2.2 黑木耳農(nóng)藝性狀遺傳多樣性分析

59個(gè)菌株的農(nóng)藝性狀研究數(shù)值統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 59個(gè)黑木耳菌株農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 The statistic data of 59 strains of Auricularia heimuer based on agronomic traits

由表3可知，供試菌株的15個(gè)農(nóng)藝性狀間存在不同程度的遺傳變異，變異系數(shù)范圍為6%～46%，其中變異最小的是原基形成時(shí)間，變異最大的是子實(shí)體邊緣特性。遺傳多樣性指數(shù)變化范圍為0.435～2.048，多樣性指數(shù)最小的是原基形成時(shí)間，耳片厚度指標(biāo)的遺傳多樣性指數(shù)最大。

2.3 農(nóng)藝性狀聚類(lèi)分析及產(chǎn)量回歸模型的構(gòu)建

15個(gè)農(nóng)藝性狀的歐式距離聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 15個(gè)農(nóng)藝性狀的聚類(lèi)分析Fig.2 Cluster analysis of 15 agronomic traits

如圖2所示，在歐氏距離10.0處，15個(gè)農(nóng)藝性狀被分為兩大類(lèi)。第一類(lèi)涵蓋了子實(shí)體形狀、子實(shí)體腹面褶皺、子實(shí)體背面褶皺、子實(shí)體邊緣特性、原基顏色、子實(shí)體顏色等11個(gè)農(nóng)藝性狀，以賦值性狀為主，表明這些賦值性狀彼此之間的相關(guān)性較高。第二類(lèi)涵蓋了產(chǎn)量、耳片長(zhǎng)度、耳片寬度等信息，表明這幾個(gè)性狀間存在一定程度的相關(guān)性。

通過(guò)此證據(jù)進(jìn)一步利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，通過(guò)多元逐步回歸分析的方法構(gòu)建產(chǎn)量（Y）與發(fā)菌時(shí)間（X1）、耳片厚度（X2）、耳片長(zhǎng)度（X3）、耳片寬度（X4）之間的最優(yōu)回歸模型，得到的回歸方程式為：

由此可見(jiàn)，產(chǎn)量和發(fā)菌時(shí)間、耳片厚度、耳片長(zhǎng)度呈正相關(guān)，與耳片寬度呈負(fù)相關(guān)。產(chǎn)量性狀與其關(guān)系緊密的4個(gè)性狀相關(guān)程度依次為：耳片厚度（X2）>耳片寬度（X4）>發(fā)菌時(shí)間（X1）>耳片長(zhǎng)度（X3）。在其他變量保持不變的前提下，耳片厚度每提升一個(gè)單位，產(chǎn)量會(huì)相應(yīng)的提升6個(gè)單位，耳片厚度是影響產(chǎn)量的重要指標(biāo)之一。

2.4 主成分分析

對(duì)59個(gè)菌株的15個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 主成分分析方差解釋Tab.4 Total variance explained by principal component analysis

由表4可知，前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為96.067%，表明這4個(gè)因子所含的信息可解釋全部信息量的96%，符合分析要求。

對(duì)前4個(gè)主成分的載荷矩陣進(jìn)行分析，見(jiàn)表5。

表5 主成分載荷矩陣Tab.5 Principal component loading matrix

由表5可知，耳片長(zhǎng)度、耳片寬度在第1個(gè)、第3個(gè)主成分上有較高的載荷值，這2個(gè)主成分主要解釋了這2個(gè)變量，可以把第1個(gè)和第3個(gè)主成分綜合解釋為子實(shí)體形態(tài)性狀指標(biāo)；產(chǎn)量和耳片寬度2個(gè)性狀在第2個(gè)主成分上有較高的載荷值，可以把第2個(gè)主成分解釋為產(chǎn)量因子；發(fā)菌時(shí)間和原基形成時(shí)間2個(gè)性狀在第4個(gè)主成分上有較高的載荷值，可以把第4個(gè)主成分解釋為營(yíng)養(yǎng)發(fā)育因子。此4個(gè)主成分分別從營(yíng)養(yǎng)發(fā)育角度、子實(shí)體形態(tài)性狀角度和產(chǎn)量角度綜合評(píng)價(jià)了木耳菌株。同時(shí)這些性狀也是作為木耳菌株特性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。

2.5 基于農(nóng)藝性狀對(duì)59個(gè)菌株的聚類(lèi)分析

對(duì)59個(gè)木耳菌株15個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行歐式距離聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于農(nóng)藝性狀對(duì)59個(gè)木耳菌株的聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis of 59 strains of Auricularia heimuer based on agronomic traits

如圖3所示，在歐式距離20的水平上將供試菌株分為兩大類(lèi)。綜合SSR聚類(lèi)分析結(jié)果和農(nóng)藝性狀可知，此聚類(lèi)圖與SSR聚類(lèi)結(jié)果關(guān)聯(lián)度不大，與農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)度很大。類(lèi)群1包括AU95、AU113等25個(gè)菌株，其最典型的特征是子實(shí)體多為典型的元寶型，腹面和背面的褶皺多為平滑型。類(lèi)群2包括AU71、AU117、AU126等34個(gè)菌株，這個(gè)類(lèi)群在歐式距離為16的水平上又分為3個(gè)亞類(lèi)，總體來(lái)講，盡管有AU64、AU79、AU70等少數(shù)幾株元寶型子實(shí)體菌株編入了這個(gè)類(lèi)群，但這個(gè)類(lèi)群的木耳子實(shí)體多數(shù)為菊花型，且腹面背面的褶皺明顯。

3 討論

木耳種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)研究多集中在分子標(biāo)記的研究方面[25-26]，但近年來(lái)基于農(nóng)藝性狀的多樣性研究也愈來(lái)愈多，農(nóng)藝性狀是實(shí)際的感官或測(cè)量指標(biāo)，作為評(píng)價(jià)種質(zhì)資源多樣性研究的指標(biāo)一直扮演著極其重要的角色。以農(nóng)藝性狀指標(biāo)為基礎(chǔ)，結(jié)合SSR分子標(biāo)記，評(píng)價(jià)了59個(gè)木耳菌株的遺傳多樣性，最終發(fā)現(xiàn)分子指標(biāo)的聚類(lèi)結(jié)果和子實(shí)體的農(nóng)藝性狀沒(méi)有必然聯(lián)系，兩者只能從不同角度揭示菌株間的遺傳差異。

基于農(nóng)藝性狀的菌株聚類(lèi)結(jié)果將供試菌株分為兩大類(lèi)群，與子實(shí)體形狀及耳片腹面、背面的褶皺情況有極大的關(guān)系，但是與耳片長(zhǎng)、寬、厚等指標(biāo)關(guān)系不大。15個(gè)農(nóng)藝性狀的聚類(lèi)結(jié)果表明，各農(nóng)藝性狀間存在一定的聯(lián)系。多元逐步回歸表明，木耳的產(chǎn)量和發(fā)菌時(shí)間、耳片長(zhǎng)度、寬度、厚度具有一定的線性關(guān)系。在木耳育種進(jìn)程中，要充分協(xié)調(diào)好外觀、品質(zhì)、產(chǎn)量等性狀，依據(jù)科學(xué)的指導(dǎo)和管理，提高生產(chǎn)效益。