吳小翠 楊智華 謝毅強 李 瑞 程亞偉

1.海南省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南?？?570203；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006；3.海南醫(yī)學院中醫(yī)學院，海南?？?571199；4.海南省中醫(yī)院眼科，海南?？?570203；5.海南省中醫(yī)院治未病中心，海南?？?570203

糖尿病及其并發(fā)癥是全球第九大死亡原因，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）就是其中最常見的一種[1]。DR 的發(fā)生被認為與低度炎癥[2]、氧化應激[3]等多種分子途徑機制有關(guān)，其發(fā)生與發(fā)展與糖尿病血糖控制息息相關(guān)[1]。非增殖期DR（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）是DR 的早期階段，其特征為視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、微動脈瘤和棉絮斑等[4]，西醫(yī)治療常在控制血糖的基礎(chǔ)上給予營養(yǎng)神經(jīng)、抑制血管生成、促進微循環(huán)的藥物，并配合激光治療[5-7]。但常規(guī)的治療手段如糖皮質(zhì)激素往往會引起眼內(nèi)壓增高、惡心、嘔吐等不良反應，而中醫(yī)藥治療NPDR 則著眼于辨證施治、調(diào)理臟腑[8-9]，治療疾病的同時個性化地改善患者的不良反應，已逐漸成為NPDR治療中不可或缺的一環(huán)。本研究采用數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接技術(shù)對中醫(yī)藥治療NPDR 的中藥方劑進行系統(tǒng)分析，挖掘相關(guān)的分子機制，為后續(xù)的機制研究打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 中藥治療NPDR 處方數(shù)據(jù)挖掘

1.1.1 文獻來源 檢索中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫中有關(guān)中醫(yī)藥治療NPDR 的相關(guān)文獻，檢索期限為數(shù)據(jù)庫建庫至2020 年12 月。

1.1.2 納入標準①主題含“糖尿病視網(wǎng)膜病變”“糖網(wǎng)”或“消渴目盲”“消渴”；“中醫(yī)藥”“中草藥”或“中醫(yī)”或“中藥”。②使用口服單純中藥或以口服中藥為主結(jié)合其他方法治療NPDR 的臨床研究。

1.1.3 排除標準①處方組成有缺失；②綜述、單純動物實驗的文獻；③個人經(jīng)驗、個案報道。

1.1.4 中藥規(guī)范化處理 參考《中藥學》[10]、《中華人民共和國藥典》[11]，對納入文獻中的藥物名稱及性味、歸經(jīng)進行規(guī)范化處理。如“法半夏”“姜半夏”“制半夏”統(tǒng)一為“半夏”，“玄胡”“元胡”統(tǒng)一為“延胡索”等。

1.1.5 方劑錄入與核對 依照上述規(guī)范化處理原則，將整理好的處方一一錄入計算平臺的“方劑管理”模塊，一位研究人員錄入，另一位研究人員進行二次審核校對，以確保數(shù)據(jù)資料準確無誤。

1.1.6 數(shù)據(jù)分析 采用中醫(yī)傳承計算平臺V3.0 的“藥物統(tǒng)計”對藥物的使用、性味、歸經(jīng)的頻率、頻次及分布進行統(tǒng)計分析；運用“數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)”進行組方規(guī)律分析及聚類分析，設(shè)置支持度為15%，置信度為0.5。

1.2 高頻藥對網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

1.2.1 高頻藥對有關(guān)化學成分和基因的獲取 將數(shù)據(jù)挖掘所得到使用頻次最高的藥對組合輸入中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫，并按照口服利用度≥30%，成藥相似性≥0.18 的篩選條件，在兩個數(shù)據(jù)庫中獲取該藥對組合的主要化學成分以及可能作用的靶點。將所得的靶點名稱輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫以查找有關(guān)靶點對應的基因名以及編號。最后，將靶基因和中藥主要化學成分作映射，構(gòu)建“成分-靶點”圖。

1.2.2 糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶點收集 在GeneCards數(shù)據(jù)庫以“non-proliferative diabetic retinopathy”“diabetic retinopathy”為主要檢索詞搜索與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關(guān)的疾病作用靶點，選擇Score 值≥10 的疾病靶點與高頻藥對中的相關(guān)基因進行交叉，得到高頻藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用基因。

1.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將高頻藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用基因輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇“Homo sapiens”類別后，設(shè)置置信度為0.4。將所獲得的分析結(jié)果以tsv 文件形式導入Cytoscape 3.7.2 中，根據(jù)Cytoscape 軟件的程序包進行計算，篩選出節(jié)點度值較大的靶點作為PPI 核心網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 KEGG 和GO 富集分析 將高頻藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用基因輸入R 軟件（R 4.0.2），調(diào)用clusterProfiler 包，對這些基因從細胞組分、分子功能、生物過程3 個方面進行注釋。GO 分析是對基因本身功能的注釋，而KEGG 分析則是對于基因參與人體活動的相關(guān)通路注釋。利用R 語言程序中的cluster-Profiler 程序包對關(guān)鍵靶點基因進行GO 富集分析。GO 結(jié)果均以條形圖格式輸出。將關(guān)鍵靶點基因用R語言程序中的pathview 程序包進行KEGG 富集通路分析，以基因比率為橫軸、通路名稱為縱軸、氣泡顏色代表P 值，繪制氣泡圖。

1.2.5 分子對接技術(shù) 在RSCB-PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）查找篩選出的排名最高的晶體結(jié)構(gòu)，利用ZINC 數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org/）查找篩選出的口服利用度及成藥相似度最高的化學成分的Mol2 結(jié)構(gòu)式，將活性成分與靶標一并導入AutoDock 軟件，對活性成分和靶標進行虛擬分子對接分析。一般認為，結(jié)合能＜0 的分子即可自行結(jié)合，而數(shù)值越小結(jié)合力越強，既往同行研究提示，結(jié)合能≤-5 kJ/mol 可視為該化學成分可與作用靶標有效結(jié)合[12]。

2 結(jié)果

2.1 中藥頻次

通過文獻篩選獲得107 首處方，共涉及151 味中藥，累計頻次達936 次。其中頻次≥10 次的有27 味，見表1。

2.2 中藥功效、歸經(jīng)及四氣五味

151 味中藥共涵蓋10 種功效，其中使用頻次較高的包括補虛類、清熱類、活血化瘀類。四氣以寒、平、溫性為主；五味主要以苦、甘味為主；歸經(jīng)主要歸為肝、肺、腎經(jīng)。見圖1。

圖1 中藥功效、歸經(jīng)、四氣、五味統(tǒng)計圖

2.3 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

藥物核心組合的頻次及關(guān)聯(lián)程度見表2～3、圖2，其中中藥組合黃芪-生地出現(xiàn)頻次最高。

圖2 藥物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

表2 藥物核心組合頻次（前10 位）

表3 藥物核心組合關(guān)聯(lián)程度（前10 位）

2.4 高頻藥對黃芪-生地治療NPDR 的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

2.4.1 藥物成分及靶點篩選、NPDR 關(guān)鍵靶點篩選及網(wǎng)絡(luò)分析 得到黃芪、生地的活性成分共26 個，以及對應的靶點1 280 個。剔除重復項和無對應活性成分的靶點后，得到黃芪、生地的活性成分靶點共497 個。將NPDR 相關(guān)的疾病靶點與黃芪、生地的活性成分靶點匹配映射，得到共同靶點47 個，即黃芪-生地藥對治療NPDR 的關(guān)鍵靶點。將中藥活性成分、關(guān)鍵靶點導入Cytoscape 軟件，構(gòu)建中藥活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)中有61 個節(jié)點（包括14 個活性成分及47 個關(guān)鍵靶點）。在該網(wǎng)絡(luò)中，藥物活性成分與關(guān)鍵靶點之間的連線代表該活性成分可能與這個關(guān)鍵靶點有聯(lián)系，連線越多提示該成分在治療NPDR 的過程中發(fā)揮的作用越大。連線較多的藥物活性成分有槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol 等。

圖3 活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 關(guān)鍵靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。PPI 核心網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點度值越大提示該蛋白在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的位置越重要，得到黃芪-生地藥對治療NPDR 的核心靶點有SPP1、TP53、SERPINE1、PTGS2、FOS、CCND1、VEGFA、TNF 等，見圖5。

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.3 GO 與KEGG 富集分析 關(guān)鍵靶點GO 富集分析結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵靶點基因涉及1 942 條通路，靶點基因數(shù)目前30 條繪制成柱狀圖見圖6，關(guān)鍵靶點KEGG 通路分析見圖7，可見黃芪-生地藥對治療NPDR 的主要通路包括有細胞對化學應激的反應、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、上皮細胞增殖、細胞對脂多糖反應等。

圖6 GO 富集通路柱狀圖

圖7 KEGG 富集通路氣泡圖

2.4.4 分子對接分析 根據(jù)“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中交集靶點的運算結(jié)果，篩選出黃芪-生地藥對中的核心活性成分有兩個，分別是槲皮素、山柰酚，其成分化學結(jié)構(gòu)見圖8。以網(wǎng)絡(luò)連線數(shù)（分值）為主要依據(jù)，篩選得到4 個核心靶點蛋白VEGFA、CASP3、ICAM1、SERPINE1，其關(guān)聯(lián)性均0.595 588 235，網(wǎng)絡(luò)分值及網(wǎng)絡(luò)連線數(shù)均為19，特征向量均為0.228 793 263。對核心活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接。核心靶點蛋白和核心活性成分對接的自由能計算結(jié)果顯示，槲皮素與VEGFA、ICAM1、SERPINE1的結(jié)合能分別為-8.1、-6.7、-6.7 kJ/mol，山柰酚與CASP3 的結(jié)合能為-7.3 kJ/mol，提示其與NPDR 中的關(guān)鍵核心靶點有良好的結(jié)合作用。見圖9～10。

圖8 黃芪-生地藥對核心活性成分化學結(jié)構(gòu)

圖9 槲皮素與 與VEGFA、ICAM1、SERPINE1 的對接示意圖

3 討論

NPDR 是由于血糖控制不佳引起的糖尿病常見微血管并發(fā)癥之一，屬于中醫(yī)范疇中的“消渴目病”范疇，多因為臟腑功能失調(diào)，氣血痹阻、陰陽平衡失調(diào)導致消渴病，而消渴病日久遷延至雙目所致，中醫(yī)藥對本病的治療效果確切[13]。為更好地總結(jié)近年來各家用中醫(yī)藥治療NPDR 的學術(shù)思想與用藥經(jīng)驗，本研究同時采用數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學分析方法，探討中藥治療NPDR 的一般規(guī)律和關(guān)鍵藥物的作用機制，可以為中醫(yī)藥治療NPDR 提供一個重要的參考依據(jù)。

圖10 山柰酚與CASP3 對接示意圖

對處方進行功效、歸經(jīng)分析，分析結(jié)果提示最常用的中藥為補虛藥，其次為清熱藥與活血化瘀藥，主要歸肝、脾、腎經(jīng)。對納入的151 味中藥進行關(guān)聯(lián)分析得到治療NPDR 的核心中藥，其中包括黃芪、生地、葛根、三七等。其中黃芪益氣固表，養(yǎng)血生肌；生地黃清熱生津、涼血止血；葛根清熱解毒，生肌止渴；三七活血化瘀。其中黃芪常與生地配伍共同發(fā)揮益氣養(yǎng)陰，清熱生津，涼血止血的功效。中醫(yī)認為NPDR 的發(fā)病病機為氣陰兩虛、陰虛火旺或氣血瘀滯，提示治療應當以益氣養(yǎng)陰、補益肝腎、清熱涼血、化瘀通絡(luò)為主[14]，配以益氣健脾[15]。四氣五味統(tǒng)計結(jié)果提示治療NPDR的中藥多以寒、溫、平及甘、苦為主，甘味平性藥多為益氣健脾補虛中藥，性寒味苦的中藥多具有疏風清熱涼血功效，辛溫的中藥多能疏肝健脾，因此在臨床上較為常用。目前中醫(yī)各家比較一致地認為，消渴目病是由于先天稟賦不足或后天失養(yǎng)，導致肝腎陰虛，陰虛生火，虛火灼精，血液黏稠成瘀，精、氣、血不能上養(yǎng)于目所致[16]。因此NPDR 的中醫(yī)治療以標本兼治為原則，治本以益氣養(yǎng)陰為主，治標則當活血化瘀。

治療NPDR 的核心中藥藥對黃芪-生地中的活性成分包括槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol 等。槲皮素能有效減輕高糖條件下人腎小球內(nèi)皮細胞損傷，從而抑制糖尿病進展，這一作用與激活PI3K/Akt 通路調(diào)節(jié)細胞活力、細胞凋亡、凋亡基因mRNA 表達量有關(guān)[17-18]；亦可通過調(diào)控細胞自噬抑制高糖誘導的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管生成[19]，對延緩、減輕DR 具有一定作用。山柰酚對高糖條件下人腎小球內(nèi)皮細胞氧化應激及凋亡具有抑制作用，可控制糖尿病腎損傷[20]。徐曉紅等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚通過靶向VEGF 和PGF 基因抑制微血管發(fā)生，抑制Src-Akt1-Erk1/2 信號通路的激活，可能是治療DR 的潛在藥物。刺芒柄花素屬于黃芪總黃酮的一種，通過抑制缺氧ARPE-19 細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子，防止體內(nèi)缺氧誘導的視網(wǎng)膜血管新生[22]。異鼠李素能有效抑制氧化應激損傷[23]，這可能對高糖狀態(tài)下的視網(wǎng)膜損害具有保護作用。PPI 網(wǎng)絡(luò)中黃芪-生地治療NPDR 的核心靶點包括SPP1、TP53、SERPINE1、PTGS2、FOS、MAPK1、VEGFA、TNF 等。其中TNF 基因編碼一種多功能促炎性細胞因子，屬于腫瘤壞死因子超家族，這種細胞因子主要由巨噬細胞分泌，參與調(diào)節(jié)胰島素抵抗，在糖尿病發(fā)展中起到不可忽視的作用[24]。SERPINE1 基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，絲氨酸蛋白酶抑制劑具有增加胰島素敏感性、調(diào)節(jié)脂類代謝及調(diào)節(jié)血糖代謝等功能[25]，可通過調(diào)控TNF、SERPINE1 表達量，減輕胰島素抵抗，繼而延緩糖尿病進展及并發(fā)癥的發(fā)生。VEGFA 基因編碼一種肝素結(jié)合蛋白，以二硫鍵連接的同二聚體存在，這種生長因子誘導血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，參與視網(wǎng)膜病理血管生成[26]，對改善視網(wǎng)膜血管病變可能有直接作用。TP53 調(diào)節(jié)細胞代謝（包括細胞自噬及細胞成分的分解和重塑），通過這些代謝活動維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和支持細胞生長[27]，其信號通路影響線粒體功能和視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖[28]。黃芪-生地藥對的核心有效成分與核心靶點蛋白進行模擬對接的結(jié)合能＜-5 kJ/mol，提示有效成分和靶點蛋白之間的結(jié)合較為緊密，黃芪-生地藥對對NPDR 有潛在治療效果，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果，后續(xù)可進一步研究山柰酚、槲皮素、異鼠李素、刺芒柄花素等干預NPDR 的作用與機制，過表達或敲除相關(guān)核心靶點研究其上下游關(guān)系，探索中藥治療NDPR 新機制。

黃芪-生地參與治療NPDR 的主要通路可能包括細胞對化學應激的反應、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、細胞對脂多糖反應、上皮細胞增殖等。氧化應激損傷胰島β 細胞和降低外周組織對胰島素的敏感性，導致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]；生物活性氧包括O2、OH-、H2O2、NO 等，是線粒體氧化代謝的產(chǎn)物，為氧化應激的主要標志物。活性氧在糖尿病及并發(fā)癥機制中的作用主要是對組織和細胞的毒性損傷，還是重要的細胞內(nèi)信使，能夠活化許多信號傳導通路，間接損傷組織和細胞[29-30]。上皮細胞增殖同樣屬于糖尿病視網(wǎng)膜病損的重要因素，在高糖狀態(tài)下，包括視網(wǎng)膜色素上皮細胞在內(nèi)的細胞更新（凋亡、增殖、肥大）模式會隨著線粒體活性氧和氧化應激的增加，最終導致視網(wǎng)膜血管生成和組織重塑[3]。

綜上所述，中醫(yī)藥治療NPDR 以益氣養(yǎng)陰、補益肝腎、清熱涼血、化瘀通絡(luò)為常規(guī)治則，用藥以補虛最為多見，次而配伍清熱涼血。文獻處方中的核心組合黃芪-生地，可能主要通過槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等活性成分，作用于SPP1、TP53、SERPINE1、PTGS2、FOS、CCND1、VEGFA、TNF 等相關(guān)疾病靶點，調(diào)控對化學應激的反應、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、上皮細胞增殖等相關(guān)細胞信號通路，共同發(fā)揮NPDR 的治療作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療針對多靶點、多通路的特點。但是本研究僅在理論上研究中醫(yī)藥治療NPDR 的一般規(guī)律和相關(guān)機制，后續(xù)仍需要更多臨床實踐和進行相關(guān)實驗予以驗證。