劉夢(mèng)真 孫蓉蓉 劉艷華 張有為

1.徐州醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，江蘇徐州 221009；2.江蘇省徐州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇徐州 221009

惡性腫瘤已成為我國(guó)居民的主要死因，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因具有重要意義[1]。FAM83H 位于染色體8q24.3，是FAM83 家族成員之一，最初因其在牙齒發(fā)育中的重要作用被關(guān)注，F(xiàn)AM83H 在肝細(xì)胞癌、腎癌、胃癌、胰腺癌和宮頸癌等腫瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[2-6]。FAM83H-AS1 位于FAM83H 的對(duì)側(cè)，是其天然反義轉(zhuǎn)錄本，二者以頭對(duì)頭（5’-5’）形式互補(bǔ)重疊。研究表明，F(xiàn)AM83H-AS1 是多種腫瘤潛在的診斷、預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7-9]。本研究擬在泛癌種水平研究FAM83H 和FAM83H-AS1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CCK-8 購(gòu)于Signalway Antibody（CP002）；Transwell小室購(gòu)于Costar（3422）；Trizol 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司（1596026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas（#K1622）；SYBR Green PCR 試劑盒（#K0223）、BCA 蛋白定量試劑盒（PICPI23223）、兔抗人FAM83H 多克隆抗體（PA5-55094）購(gòu)于Thermo；兔抗人GAPDH 單克隆抗體（#5174）購(gòu)于CST；羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗（A0208）、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1036）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

在線分析FAM83H 基因在惡性腫瘤中的表達(dá)及預(yù)后，測(cè)試數(shù)據(jù)集來自基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn）[10]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

siFAM83H 與siFAM83H-AS1 干涉載體由上?；鶢栴D生物公司構(gòu)建。A549、SKOV3 細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為空載對(duì)照組（siNC 組）和實(shí)驗(yàn)組（siFAM83H 組、siFAM83H-AS1組），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（control 組），細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen 公司）介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究所有實(shí)驗(yàn)步驟均重復(fù)3 次。

1.4 Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)

胰酶消化并收集各組細(xì)胞，Trizol 試劑盒提取總RNA，并對(duì)提取的RNA 進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。在37℃60 min、85℃5 min、4℃5 min 的條件下，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成的cDNA 按Real-time PCR 試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增：95℃10 min（95℃15 s，60℃45 s），40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s；以GAPDH 作為內(nèi)參，檢測(cè)FAM83H、FAM83H-AS1 的表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot 檢測(cè)

RIPA 法提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。上樣后SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，二抗（1∶1 000）37℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，ECL 系統(tǒng)顯影（GAPDH 作內(nèi)參）。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

胰酶消化細(xì)胞，鏡下記數(shù)將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為3×104個(gè)/ml。按3×103個(gè)/孔，將細(xì)胞種至96 孔培養(yǎng)板，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h 后，加入CCK-8 試劑，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后制備成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取1 ml 懸液離心收集細(xì)胞，Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，4℃避光孵育15 min后，加入碘化丙啶染色液，4℃避光孵育5 min 后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 Transwll 檢測(cè)細(xì)胞遷移

胰酶消化細(xì)胞，用含1% FBS 的培養(yǎng)基制備3×105個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，每個(gè)Transwell 小室接種300 μl細(xì)胞懸液，下層加入700 μl 的含10% FBS 的培養(yǎng)基，每組細(xì)胞設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，取出小室，PBS 清洗2 次，甲醛固定10 min，PBS 洗滌2 次，0.5%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 洗滌3 次，晾干后于顯微鏡下觀察拍照（200×），計(jì)數(shù)不同視野下的細(xì)胞數(shù)取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM83H、FAM83H-AS1mRNA 在泛癌種水平的表達(dá)

GEPIA 在線工具分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83H mRNA在乳腺浸潤(rùn)癌、胸腺瘤、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鱗癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱尿路上皮癌、直腸癌、宮頸鱗癌和腺癌、子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤、卵巢漿液性囊腺瘤（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中表達(dá)上調(diào)；在多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、急性髓系白血病和皮膚黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)。FAM83H-AS1 mRNA 在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤(rùn)癌、宮頸鱗癌和腺癌、結(jié)腸癌、LUAD、肺鱗癌、OV、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤中表達(dá)上調(diào)，在急性髓系白血病、皮膚黑色素瘤和睪丸癌中表達(dá)下調(diào)。見圖1。

圖1 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 在泛癌種水平的表達(dá)

2.2 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 表達(dá)與LUAD和OV 的預(yù)后

在LUAD 中，F(xiàn)AM83HmRNA 高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 表達(dá)與LUAD 和OV 的預(yù)后

2.3 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組FAM83H、FAM83H-AS1 表達(dá)比較

A549 和SKOV3 細(xì)胞中，siFAM83H 組FAM83H mRNA 及蛋白表達(dá)低于siNC 組（P＜0.05）；siFAM83HAS1 組FAM83H-AS1 mRNA 表達(dá)低于siNC 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組FAM83H、FAM83H-AS1 表達(dá)比較（n＝3）

2.4 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組細(xì)胞增殖能力比較

A549 和SKOV3 細(xì)胞中，siFAM83H 組轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后細(xì)胞增殖能力低于siNC 組（P＜0.05）。siFAM83H-AS1 組轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后細(xì)胞增殖能力低于siNC 組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后細(xì)胞增殖能力比較（n＝3）

2.5 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組細(xì)胞凋亡數(shù)量比較

A549 和SKOV3 細(xì)胞中，siFAM83H 組、siFAM83HAS1 組凋亡數(shù)量高于siNC 組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組流式結(jié)果

2.6 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組細(xì)胞遷移數(shù)比較

A549 和SKOV3 細(xì)胞中，siFAM83H 組、siFAM83HAS1 組細(xì)胞遷移數(shù)低于siNC 組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組Transwll 檢測(cè)結(jié)果（結(jié)晶紫染色，200×）

2.7 FAM83H、FAM83H-AS1 表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

FAM83H 與FAM83H-AS1 以頭對(duì)頭（5’-5’）形式互補(bǔ)重疊，推測(cè)二者存在相互調(diào)控關(guān)系。A549 和SKOV3細(xì)胞中，F(xiàn)AM83H 后敲低，siFAM83H 組 與siNC 組siFAM83H-AS1 mRNA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FAM83H-AS1 敲低后，siFAM83H-AS1 組 與siNC 組siFAM83HmRNA 和蛋白比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。尚不能認(rèn)為FAM83H 與FAM83HAS1 之間存在調(diào)控關(guān)系。

圖7 FAM83H、FAM83H-AS1 表達(dá)的關(guān)聯(lián)性（n＝3）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83H 和FAM83H-AS1 在多種腫瘤中上調(diào)，敲低FAM83H 或FAM83H-AS1 后，可抑制A549、SKOV3 細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示二者在LUAD 和卵巢癌中具有癌基因的作用。

既往研究證實(shí)，F(xiàn)AM83H 基因在人類多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且與不良預(yù)后相關(guān)，其機(jī)制涉及不同信號(hào)通路[11-13]。肝細(xì)胞癌中FAM83H 誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2 表達(dá)，癌基因MYC 結(jié)合到FAM83H 啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[2]；胃癌中FAM83H 與Scrib 表達(dá)密切相關(guān)，F(xiàn)AM83H 和Scrib 可能通過穩(wěn)定β-catenin 參與胃癌的進(jìn)展[4]；胰腺癌中FAM83H 過表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)減少及Ras-PI3K-mTOR 信號(hào)通路有關(guān)[5]；FAM83H 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)增加，與患者的臨床分期密切相關(guān)[14]。但FAM83H在卵巢癌中的表達(dá)尚未見報(bào)道，而本研究首次明確FAM83H 在LUAD 和卵巢中的生物學(xué)功能。

FAM83H-AS1 作為FAM83H 的天然反義轉(zhuǎn)錄本，其表達(dá)升高促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[15-17]。FAM83H-AS1是LUAD 組織明顯上調(diào)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA 之一，F(xiàn)AM83H-AS1 通過調(diào)控Met/EGFR 信號(hào)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]；FAM83H-AS1 還可以結(jié)合hnRNP K 以增強(qiáng)抗凋亡基因RAB8B 和RAB14 的翻譯，從而抑制LUAD 凋亡[19]。FAM83H-AS1 在卵巢癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度相關(guān)，下調(diào)其表達(dá)可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲[20-21]；此外，F(xiàn)AM83HAS1 通過穩(wěn)定HUR 蛋白參與卵巢癌的輻射抵抗和細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22]。本研究進(jìn)一步證實(shí)FAM83H-AS1 在LUAD和卵巢癌中的生物學(xué)功能。

有研究報(bào)道，內(nèi)源性反義長(zhǎng)鏈非編碼RNA 參與人類細(xì)胞基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控[23]，其表達(dá)水平與宿主基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，提示編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄本在特定的生物學(xué)途徑中存在協(xié)同調(diào)節(jié)[24]。在食管癌中，F(xiàn)AM83H-AS1 與其正義鏈FAM83H在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在一致性調(diào)節(jié)，F(xiàn)AM83H-AS1可能通過調(diào)控FAM83H 的表達(dá)而發(fā)揮癌基因作用[25]。盡管FAM83H 與FAM83H-AS1 在泛癌種水平的表達(dá)趨向一致，但是本研究未在細(xì)胞水平證實(shí)二者對(duì)彼此表達(dá)的影響，F(xiàn)AM83H 與FAM83H-AS1 可能獨(dú)立發(fā)揮作用，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。