廖星合，劉占濤，劉明輝

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院綜合治療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.廣東省人民醫(yī)院贛州醫(yī)院（贛州市立醫(yī)院）神經(jīng)外科，江西 贛州 341000

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦瘤中發(fā)病率最高的腫瘤，因其獨(dú)特的生物學(xué)特性［1-2］導(dǎo)致患者治療難度大、致殘和致死率高及預(yù)后差［3-4］。因此，探索新的診斷標(biāo)志物和治療方法顯得極其重要和緊 迫。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［5-6］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HOXA集群反義RNA2（HOXA-AS2）與膠質(zhì)瘤相關(guān)［7-8］。然而HOXA-AS2調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不清楚。腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞（cancer stem-like cell，CSC）具有自我更新和形成大塊腫瘤的能力［9-10］。CSC與非CSC可以互相轉(zhuǎn)化［11］，既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了這一過程［12］。然而目前HOXA-AS2與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）的關(guān)系尚未確定。外泌體可以通過傳遞細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、DNA、miRNA、lncRNA和mRNA）來介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用［13］。此外，腫瘤源性外泌體與腫瘤發(fā)生及腫瘤微環(huán)境有關(guān)［14］。然而，含有HOXA-AS2的GSC來源外泌體是否對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和干細(xì)胞特性有影響尚不清楚。因此，本研究對上述問題進(jìn)行探究。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)試劑

人皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、SHG44、U251MG和HEK-293T細(xì)胞均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基、TRIzol?試劑、免疫磁珠分選試劑盒、RIPA緩沖液、ECL檢測試劑、死亡細(xì)胞凋亡試劑盒、Step-One Plus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）系統(tǒng)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。EntiLinkTM第1鏈cDNA試劑盒、EnTurboTMSYBRGreen PCR SuperMix系統(tǒng)購自武漢科鹿生物科技有限公司。FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。CD133兔單抗（1∶1 000）、SOX2兔單抗（1∶1 000）、OCT4兔單抗（1∶1 000）、cleaved caspase 3兔單抗（1∶1 000），CD9兔單抗（1∶1 000）、CD63兔單抗（1∶1 000）、CD81兔單抗（1∶1 000）、TSG101兔單抗（1∶1 000）和β-actin小鼠單抗（1∶1 000）等所有一抗和相應(yīng)二抗均購自英國Abcam公司。PKH26細(xì)胞膜染料、transwell小室購自美國Merck公司。pLVX-IRES-PURO HOXA-AS2慢病毒質(zhì)粒和含靶向HOXA-AS2質(zhì)粒購自美國克隆泰克實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。Cell-Light EdU Apollo567體外試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 臨床數(shù)據(jù)獲取

從中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（the Chinese Glioma Genome Altas，CGGA; http://www.cgga.org.cn）和癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫下載了包含低級別腦膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）和高級別腦膠質(zhì)瘤（high-grade glioma，HGG）lncRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。本研究從CGGA數(shù)據(jù)庫中選取312例患者信息，從TCGA數(shù)據(jù)庫中選取975例患者信息，包括性別、年齡、生存時(shí)間及l(fā)ncRNA表達(dá)情況等。

1.3 方法

1.3.1 識別差異表達(dá)lncRNA（differentially expressed lncRNA，DelncRNA）

從CGGA和TCGA數(shù)據(jù)庫下載了包含LGG和HGG lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集。用R語言識別LGG和HGG組織之間的DelncRNA。調(diào)整后P＜0.05和|log2（差異倍數(shù)）|＞2的lncRNA認(rèn)定為DelncRNA。使用維恩圖包對來自兩個(gè)數(shù)據(jù)集（CGGA和TCGA）的重疊DelncRNA進(jìn)行了識別。此外，我們通過CGGA和TCGA數(shù)據(jù)集來確定HOXA-AS2水平與膠質(zhì)瘤患者總生存期（overall survival，OS）之間的關(guān)系。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、SHG44、U251MG和HEK-293T細(xì)胞在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞均在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 RTFQ-PCR檢測

使用TRIzol?試劑分離出總RNA，再使用EntiLink?第1鏈cDNA試劑盒合成cDNA，然后使用EnTurbo?SYBR-Green PCR SuperMix和Step-One Plus RTFQ-PCR系統(tǒng)進(jìn)行RTFQPCR。溫度條件如下：在95 ℃預(yù)溫育3 min，然后在95 ℃溫育10 s，58 ℃溫育30 s，72 ℃溫育30 s，循環(huán)40次。以β-actin作為lncRNA HOXAAS2的內(nèi)參照物。使用標(biāo)準(zhǔn)2-ΔΔCq方法計(jì)算表達(dá)水平。引物序列如下：β-actin有義鏈為5’-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3’，反義鏈為5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’；HOXA - AS2有義鏈為5 ’ -GGAAGGACACGTTTCTATGCC-3’，反義鏈為5’-ACTTGGATTCTGACGGCTCAC-3’。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)篩選GSC

在本研究中，我們使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀和之前描述的免疫磁珠分選試劑盒分選CD133+細(xì)胞。SHG44細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基［包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）］中培養(yǎng)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞與CD133抗體珠復(fù)合物一起溫育，之后再加入分選液重新懸浮細(xì)胞，洗脫CD133+細(xì)胞，隨后將分離的CD133+細(xì)胞加入CD133-PE抗體，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

利用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞以獲得蛋白質(zhì)，用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)（30 μg/lane）用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜（美國Millipore公司）上，然后用5%脫脂牛奶在含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（trisbuffered saline Tween，TBST）中堵塞膜。隨后將膜與一抗在4 ℃下溫育過夜，然后與相應(yīng)的二抗（1∶5 000）在室溫下溫育。ECL檢測試劑用于檢測蛋白帶。所用的一抗如下：CD133兔單抗（1∶1 000，貨號397903，Biolegend），SOX2兔單抗（1∶1 000，貨號ab92494）、OCT4兔單抗（1∶1 000，貨號ab19857）、TSG101兔單抗（1∶1 000，貨號ab125011）購自英國Abcam公司，cleaved caspase 3兔單抗（1∶1 000，貨號AF7022）、CD63兔單抗（1∶1 000，貨號AF5117）購自美國Affbiotech公司，CD9兔單抗（1∶1 000，貨號20597-1-AP）、CD81兔單抗（1∶1 000，貨號27855-1-AP）購自美國Proteintech公司，β-actin兔單抗（1∶1 000，貨號TDY051）購自天德悅（北京）生物科技有限責(zé)任公司。以β-actin作為對照。

1.3.6 外泌體的分離和表征

從GSC 中收集上清液，使用超離心法分離外泌體，用BCA 法測定外泌體蛋白濃度，外泌體的識別使用納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）測 定。

1.3.7 外泌體攝取

從GSC中提取的外泌體（20 μg）用PKH26細(xì)胞膜染料進(jìn)行熒光標(biāo)記，膠質(zhì)瘤細(xì)胞與熒光標(biāo)記的外泌體共培養(yǎng)48 h，使用熒光顯微鏡觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體的內(nèi)化情況。

1.3.8 共培養(yǎng)系統(tǒng)

用Cy3標(biāo)記的HOXA-AS2轉(zhuǎn)染SHG44-GSC，轉(zhuǎn)染的SHG44-GSC接種于transwell?聚酯透性支架上，SHG44細(xì)胞接種于下層腔室，溫育24 h后，用共聚焦顯微鏡對SHG44細(xì)胞成像。

1.3.9 慢病毒轉(zhuǎn)染

獲取pLVX-IRES-PURO HOXA-AS2慢病毒質(zhì)粒和含靶向HOXA-AS2質(zhì)粒的慢病毒shRNA后，用慢病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒（pLP/VSVG、pLP1和pLP2）轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞72 h，然后收集含病毒的上清液，將適量的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)72 h。

1.3.10 CCK-8檢測

在相應(yīng)處理后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞被接種到96孔板（5 000個(gè)細(xì)胞/孔）中，37 °C培養(yǎng)48 h，隨后將CCK-8試劑10 μL分別加入孔中，37 °C溫育2 h，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm處對每個(gè)孔的吸光度（D）進(jìn)行評估。

1.3.11 5-乙炔基-2'-嘧啶核苷（EdU）染色

使用Cell-Light EdU Apollo567體外試劑盒測定細(xì)胞增殖，細(xì)胞用50 μmol/L EdU溫育后，用Apollo染料溶液染色，隨后使用熒光顯微鏡觀察EdU陽性細(xì)胞。

1.3.12 Transwell小室分析

使用孔徑為8 μm的transwell小室分析細(xì)胞遷移和侵襲能力，將細(xì)胞（1×105）重懸浮于200 μL無血清培養(yǎng)液中，加入上室，下室填充含10%FBS的DMEM（700 μL），溫育24 h后，用1%結(jié)晶紫對下膜表面的細(xì)胞進(jìn)行30 min的染色，隨后用熒光顯微鏡（購自日本Olympus公司）捕獲染色細(xì)胞，侵襲實(shí)驗(yàn)的條件與遷移實(shí)驗(yàn)相同，但transwell板的上室用人工基底膜預(yù)覆蓋。

1.3.13 細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞凋亡的檢測使用細(xì)胞凋亡試劑盒。細(xì)胞與Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）在暗室中溫育30 min，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0及R 4.0.1軟件。兩組之間的比較用非配對Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢測法。連續(xù)性變量數(shù)據(jù)以±s表示。使用COX回歸分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）。采用雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤中DelncRNA的識別

從CGGA數(shù)據(jù)集中鑒定出312個(gè)DelncRNA（圖1A），并從TCGA數(shù)據(jù)集中鑒定出975個(gè)DelncRNA（圖1B）。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中識別了11個(gè)重疊的DelncRNA，包括RP11-366L20.2、HOXB-AS1、RP4-792G4.2、RP11-93B14.5、HOTAIRM1、AC002454.1、CRNDE、RP11-834C11.5、HOXA-AS2、AGAP2-AS1和CTD-3049M7.1，并用維恩圖表示（圖1C）。在CGGA和TCGA數(shù)據(jù)集中，膠質(zhì)瘤患者中高水平的HOXA-AS2與較差的OS相關(guān)（圖1D～E，P均＜0.01）。此外，我們發(fā)現(xiàn)與HA1800細(xì)胞相比，T98G、SHG44和U251 MG細(xì)胞中HOXA-AS2的表達(dá)量更高（HA1800vsT98G：HR = -1.690，95% CI：-2.259 ～ -1.121，P＜0.000 1；HA1800vsSHG44：HR = -3.430，95% CI：-3.999 ～ -2.861，P＜0.000 1；HA1800vsU251MG：HR = -0.961，95%CI：- 1.530 ～ -0.392，P＜0.01，圖1F）。上述結(jié)果表明HOXA-AS2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，并且與OS呈負(fù)相關(guān)。

圖1 膠質(zhì)瘤中DelncRNA的識別Fig.1 Identification of DElncRNAs in glioma

2.2 HOXA-AS2在GSC中表達(dá)上調(diào)

本研究發(fā)現(xiàn)，SHG44-GSC中CD133 + 細(xì)胞的比例明顯高于SHG44 細(xì)胞（8 1.6%v s23.8%；HR = 0.988，95% CI：53.63 ～ 73.04，P＜0.000 1，圖2A）。此外，與親代SHG44細(xì)胞相比，SHG44-GSC中CD133（HR = -0.520，95%CI：-0.717 6 ～ -0.321 8，P＜0.000 1）、SOX2（HR = -0.482，95% CI：-0.479 4 ～ -0.283 6，P＜0.000 1）和OCT4（HR = -0.466，95%CI：- 0.664 3 ～ -0.268 5，P＜0.000 1）的表達(dá)水平明顯升高（圖2B）。而且，HOXA-AS2水平在SHG44-GSC中也顯著升高（圖2C；HR = 0.996，95% CI：2.377 ～ 2.833，P＜0.000 1）。

2.3 SHG44-GSC通過外泌體將HOXA-AS2轉(zhuǎn)移到SHG44細(xì)胞

SHG44-GSC衍生的外泌體呈圓形和杯狀，直徑50 ～ 150 nm，表達(dá)外泌體標(biāo)志物CD9、CD63、CD81和TSG101（圖3A～3B）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記的外泌體被SHG44細(xì)胞吸收（圖3C）。本研究還發(fā)現(xiàn)在SHG44細(xì)胞中觀察到Cy3標(biāo)記的HOXA-AS2（圖3D）。

本研究發(fā)現(xiàn)，HOXA-AS2 OE轉(zhuǎn)染的SHG44-GSC細(xì)胞（SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE）和SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE衍生的外泌體（SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE-Exo）中HOXA-AS2水平顯著升高（P＜0.01，圖4A、4B和4C）。然而，在HOXA-AS2 shRNA1轉(zhuǎn)染的SHG44-GSC 細(xì)胞（SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1）和來自SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1 （SHG44-GSC/HOXAAS2 shRNA1-Exo）的外泌體中該水平卻下降。在與SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE細(xì)胞共培養(yǎng)的SHG44細(xì)胞中，HOXA-AS2水平顯著升高，而與SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1共培養(yǎng)的SHG44細(xì)胞則表現(xiàn)出相反的結(jié)果（P＜0.01，圖4D）。抑制SHG44-GSC釋放外泌體后，SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE或SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1對SHG44細(xì)胞中HOXAAS2水平?jīng)]有影響（P＞0.05，圖4E）。SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE-Exo增加了SHG44細(xì)胞中HOXA-AS2的水平（HR = -2.723，95%CI：- 2.920 ～ -2.526，P＜0.000 1），而SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1-Exo則顯示出相反的結(jié)果（HR = 0.648，95% CI：0.450 5 ～ 0.844 8，P＜0.000 1，圖4F）。

圖2 HOXA-AS2在GSC中表達(dá)上調(diào)Fig.2 HOXA-AS2 is upregulated in GSC

圖3 外泌體顆粒表征Fig.3 Characterization of exosomal particles

2.4 SHG44-GSC來源的外泌體轉(zhuǎn)染HOXAAS2促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和干細(xì)胞特性

本研究發(fā)現(xiàn)SHG44-GSC/HOXA-AS2OE-Exo顯著促進(jìn)SHG44細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（P＜0.01），而SHG44-GSC/HOXAAS2 shRNA1-Exo則對SHG44細(xì)胞增殖、遷移和侵襲無明顯影響（圖5A、5B和5C）。此外，SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1-Exo顯著誘導(dǎo)SHG44細(xì)胞凋亡（P＜0.01，圖5D）。另外Western blot檢測結(jié)果顯示，SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE-Exo顯著降低SHG44細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)，而SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1-Exo則表現(xiàn)出相反的結(jié)果（P＜0.01，圖5E）。

圖4 SHG44-GSC通過外泌體將HOXA-AS2轉(zhuǎn)移到SHG44細(xì)胞Fig.4 SHG44-GSC transfer HOXA-AS2 to SHG44 cells by exosomes

3 討 論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，由于膠質(zhì)瘤的增殖能力極強(qiáng)，具有高度浸潤性，導(dǎo)致患者的預(yù)后極差，其中HGG患者的中位生存時(shí)間僅有13個(gè)月［15］。因此進(jìn)一步明確與膠質(zhì)瘤侵襲的相關(guān)分子機(jī)制十分重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療逐漸成為膠質(zhì)瘤治療的新方法，找到特異性的生物標(biāo)志物是膠質(zhì)瘤靶向治療的關(guān)鍵［16］。

lncRNA是一組長度＞200個(gè)核苷酸的非編碼RNA［17］，HOXA-AS2是lncRNA的一種，位于人染色體7p15.2，屬于HOXA簇成員，以往研究發(fā)現(xiàn)HOXA-AS2可通過結(jié)合組蛋白去甲基酶1，使染色質(zhì)發(fā)生重塑，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲［18］。既往的研究表明，過表達(dá)的HOXA-AS2可以促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［19］、胰腺癌［20］、膽囊癌［21］細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。目前有關(guān)HOXA-AS2在腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)研究較少，雖然俞盛健等［22］通過建立風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)HOXAAS2可能是腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)lncRNA，但是并沒有經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究首次運(yùn)用TCGA及CGGA 數(shù)據(jù)庫找到HOXA-AS2 為共同的DelncRNA，并分析其表達(dá)情況，結(jié)果表明，高表達(dá)的HOXA-AS2與較差的OS相關(guān)，接著我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44中的HOXA-AS2表達(dá)量明顯高于HA1800細(xì)胞，此結(jié)果表明HOXA-AS2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且與較差的患者預(yù)后相關(guān)。但其具體機(jī)制不清楚，有學(xué)者［23］認(rèn)為HOXAAS2可通過表觀遺傳學(xué)介導(dǎo)Rho家族GTPase3的表達(dá)從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，也有學(xué)者［24］認(rèn)為HOXA-AS2可通過microRNA（miRNA/miR）-373/EGFR軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

圖5 SHG44-GSC來源的外泌體轉(zhuǎn)染HOXA-AS2促進(jìn)SHG44細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲Fig.5 HOXA-AS2 transferred by SHG44-GSC-derived exosomes promoted proliferation, migration, invasion of SHG44 cells

腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了這一過程，如lncRNA H19的下調(diào)已被證明可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的致瘤性和干性［12］，然而目前HOXAAS2與GSC的關(guān)系在之前尚未確定，在本研究中，我們從SHG44細(xì)胞中分離GSC，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133+富集的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SHG44-GSC中CD133+細(xì)胞的比例明顯高于SHG44。并利用Western blot檢測干細(xì)胞相關(guān)蛋白CD133、SOX2和OCT4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SHG44-GSC中的上述干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平較SHG44中高。并且HOXA-AS2在SHG44-GSC中的表達(dá)量也明顯高于SHG44。說明lncRNA HOXA-AS2增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤的干細(xì)胞特性。

外泌體是大小為40 ～ 160 nm的細(xì)胞外囊泡，通過傳遞細(xì)胞內(nèi)的lncRNA來介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用［25］。相關(guān)研究已證實(shí)外泌體在細(xì)胞之間傳遞lncRNA的作用，如CSC和非CSC［26-27］。以往研究已證實(shí)CSC可啟動(dòng)腫瘤生成，并促進(jìn)多種人癌細(xì)胞侵襲和干細(xì)胞生長［28-30］。既往研究［31-32］表明，外泌體lncRNA在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的許多癌癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。Jiang等［33］指出GSC衍生的外泌體miR-944可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和血管生成，且Conigliaro等［34］證實(shí)來自CSC樣CD90+細(xì)胞的外泌體lncRNA H19可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。另外，Sun等［35］發(fā)現(xiàn)GSC衍生的外泌體促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和干細(xì)胞特性。本研究首先分離出SHG44-GSC衍生的外泌體，接著用PKH26染液標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的外泌體被SHG44細(xì)胞吸收，接著將轉(zhuǎn)染了Cy3標(biāo)記的HOXA-AS2的SHG44-GSC與SHG44細(xì)胞間接共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SHG44細(xì)胞中觀察到Cy3標(biāo)記的HOXAAS2。表明HOXA-AS2可通過外泌體從SHG44-GSC轉(zhuǎn)移到SHG44細(xì)胞，且通過CCK-8檢測及transwell法我們發(fā)現(xiàn)SHG44-GSC/HOXA-AS2 OEExo可顯著促進(jìn)SHG44細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究從組織表達(dá)、患者預(yù)后和細(xì)胞多個(gè)層面探究了來自SHG44-GSC的外泌體HOXA-AS2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量升高，且與患者不良預(yù)后相關(guān)，可顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和干細(xì)胞特性，提示HOXA-AS2可能是腦膠質(zhì)瘤潛在的治療靶點(diǎn)。但是本研究也有局限性，所以下一步可構(gòu)建動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，并探索下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以期在此基礎(chǔ)上研發(fā)相應(yīng)的小分子藥物應(yīng)用于臨床。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。