武 全，郭靜偉，雷雨馨，胡曉儒，王 哲

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110000

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其最常見的組織學亞型是子宮內(nèi)膜樣腺癌，約占新診斷病例的85%［1］。林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）是由DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）基因突變引起的一種常染色體顯性遺傳性疾病，是常見的癌癥易感綜合征之一，其特點是能夠增加癌癥患病風險，其中以結直腸癌和子宮內(nèi)膜癌最為多見［2］?；加蠰S的女性一生中患子宮內(nèi)膜癌的風險為40% ～ 60%［3］。

MMR系統(tǒng)能夠通過識別并糾正DNA復制過程中產(chǎn)生的錯誤配對，修復DNA損傷，來維持基因組的穩(wěn)定性。DNA錯配修復缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）可導致一種強突變表型，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），這種分子變化特點是會導致大多數(shù)LS的發(fā)生，是LS患者腫瘤的典型分子變化［4］。因此，dMMR和MSI 的識別非常重要，因為這是LS相關癌癥的重要標志，可以作為檢測LS的篩選工具［5］。

目前，國內(nèi)針對LS相關的子宮內(nèi)膜癌的研究仍處于起步階段，且多數(shù)研究數(shù)據(jù)來自歐美國家，其臨床病理學特征是否適合中國國民，仍有待考證。本研究使用特異性抗體，通過免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色方法，對515例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者進行MMR蛋白缺失的檢測，當出現(xiàn) MLH1、PMS2、MSH2及 MSH6蛋白中的一個及多個蛋白表達缺失時，則初步診斷為LS相關子宮內(nèi)膜樣腺癌；造成MLHI蛋白表達缺失的原因除MLH1基因胚系突變外，還包括MLH1基因甲基化導致的MLH1基因沉默。因此，對MLH1蛋白表達缺失患者，需進一步檢測癌組織中MLH1基因的甲基化情況，若MLH1基因甲基化陽性，則可排除LS相關子宮內(nèi)膜樣腺癌，而為散發(fā)性子宮內(nèi)膜樣腺癌。本研究旨在探討MMR蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達情況及其與患者臨床病理學特征之間的關系，并為加強LS相關的子宮內(nèi)膜樣腺癌人群篩查提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料來源

收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院2018年1月—2020年8月收治的經(jīng)手術切除全子宮的子宮內(nèi)膜樣腺癌病例，未經(jīng)人為干預隨意刪除病例，只要患者有完整的臨床數(shù)據(jù)及病理學報告數(shù)據(jù)，均納入了本研究?；颊吲R床病歷資料完整且有相應的切片及石蠟包埋標本可用于實驗。通過復閱相關病例的H-E切片及本院診斷系統(tǒng)診斷結果，統(tǒng)計患者發(fā)病年齡、腫瘤分化程度、國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會（The International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、p53有無異常表達、浸潤深度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移、有無脈管癌栓及神經(jīng)侵犯、是否累子宮下段等臨床病理學特征。本研究通過中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準。通過MMR蛋白IHC染色及MLH1基因甲基化的檢測結果，初步診斷LS相關子宮內(nèi)膜樣腺癌患者，分析其發(fā)病特點及臨床病理學特 征。

1.2 IHC染色方法及結果判讀

通過全自動IHC染色系統(tǒng)（生產(chǎn)廠家為Ventana Medical Systems，Inc），采用IHC法檢測515例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者腫瘤組織MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表達情況。首先用3.7%的甲醛液對標本進行固定，由本院病理科醫(yī)師取材，隨后依次進行脫水、石蠟包埋，切片（厚度為3 ～ 4 μm），切片行常規(guī)H-E染色及IHC染色（包括修復抗原、滴加抗體、磷酸鹽緩沖液沖洗、DAB顯色、蘇木精復染、鹽酸乙醇分化等處理），一抗分別采用鼠抗人單克隆抗體MLH1（M1）、兔抗人單克隆抗體MSH6（SP93）、鼠抗人單克隆抗體MSH2（G219-1129）及鼠抗人單克隆抗體PMS2（A16-4）。抗體均購自上海羅氏制藥有限公司。以切片內(nèi)非腫瘤細胞核著色陽性為內(nèi)對照，用磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered asline，PBS）代替一抗作為空白對照。若MMR蛋白在腫瘤細胞核明確著棕褐色即判定為陽性，不論任何比率的腫瘤細胞呈陽性，且與染色強弱以及陽性細胞彌漫或局灶分布無關。腫瘤細胞核不著色判斷為陰性。p53定位于細胞核，其陽性信號呈棕黃色或棕褐色顆粒。隨機選擇10個高倍鏡視野，計數(shù)其中陽性癌細胞的比率：p53呈現(xiàn)彌漫陽性（＞70%）或完全陰性時，均判定為p53突變型，否則為p53野生 型。

1.3 MLH1基因甲基化的檢測

對84例MLH1缺失的患者中的27例標本進行甲基化檢測，采用焦磷酸測序技術，實驗步驟按照說明書進行。PCR反應擴增儀購自美國ABI公司（反應條件為 95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，54 ℃20 s，72 ℃ 30 s，50次循環(huán)，72 ℃ 5 min），焦磷酸序列分析儀購自德國QIAGEN公司。將測序反應板置于PyroMark Q96序列分析儀中，采用配套軟件Q96 CpG Software分析目標基因位點的甲基化狀態(tài)。檢測區(qū)段共包含5個CpG位點，最終結果取5個位點平均值，正常人全血DNA的MLH1基因甲基化檢測結果≤6%，若＞6%，即判定為MLH1基因甲基化陽性。若檢測結果為MLH1基因甲基化陽性，則提示該病例為散發(fā)性子宮內(nèi)膜樣腺癌，而非LS相關的子宮內(nèi)膜樣腺癌。

1.4 腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤伴瘤周淋巴細胞

腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）定義：位于腫瘤細胞巢或腺體邊界內(nèi)的淋巴細胞（不包括腫瘤間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞和凋亡小體）。評判標準為每10個高倍鏡下（淋巴細胞數(shù)量最高的區(qū)域進行計數(shù)）淋巴細胞≥42個（圖2A），腫瘤伴瘤周淋巴細胞定義：顯微鏡放大可見瘤周有明顯的淋巴細胞聚集［6］（圖2B、C）。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 515例子宮內(nèi)膜樣腺癌MMR蛋白及p53蛋白的表達情況

515例子宮內(nèi)膜樣腺癌MMR蛋白及p53蛋白IHC染色結果顯示，陽性表達著色于細胞核，可伴有細胞質(zhì)弱陽性。本組515例患者中有138例（26.8%）發(fā)生了MMR蛋白表達缺失，MLH1、PMS2、MSH2及MSH6蛋白表達缺失率分別是16.3%（84/515）、19.0%（98/515）、5.4%（28/515）和8.0%（41/515），其中以MLH1和PMS2聯(lián)合表達缺失（60.9%，84/138）為主；其次為MSH2和MSH6聯(lián)合表達缺失（18.8%，26/138）；MSH2、MSH6和PMS2聯(lián)合表達缺失的有2例（1.4%，2/138）；PMS2、MSH2和MSH6蛋白表達單獨缺失的比例分別為8.0%（11/138）、1.4%（2/138）、10.1%（14/138）。MMR蛋白及p53蛋白表達模式見圖 1。

2.2 MLH1蛋白缺失的患者MLH1基因甲基化檢測結果

對84例MLH1缺失的患者中的27例標本進行甲基化檢測，結果顯示甲基化陽性率為85.2%（23/27），提示該23例患者可能存在因基因甲基化而導致的MLH1蛋白表達缺失，為散發(fā)型患者（圖3）。

2.3 MMR蛋白表達缺失情況與臨床病理學特征的相關性分析

515例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的MMR蛋白的表達缺失與患者發(fā)病年齡、FIGO分期、組織學分化程度、浸潤深度、脈管轉(zhuǎn)移、淋巴結轉(zhuǎn)移、p53異常表達、腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤伴瘤周淋巴細胞有關（P＜0.05），而與是否累及子宮下段無相關性（P＞0.05）。與pMMR的子宮內(nèi)膜樣腺癌患者相比，dMMR患者的發(fā)病年齡更小，F(xiàn)IGO臨床分期多為Ⅲ ～ Ⅳ期，組織學分化程度多為低分化，腫瘤多無肌層浸潤，患者多出現(xiàn)脈管、神經(jīng)侵犯及淋巴結轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤淋巴細胞增多，且腫瘤伴瘤周淋巴細胞更顯著，MSH6蛋白缺失患者多無p53異常表達。具體情況見表1。

圖1 子宮內(nèi)膜樣腺癌中MMR蛋白及p53蛋白的表達Fig.1 The expression of MMR protein and p53 protein in endometrioid adenocarcinoma

圖2 腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤伴瘤周淋巴細胞Fig.2 Tumor infiltrating lymphocytes and tumor with peritumoral lymphocytes

圖3 MLH1蛋白表達缺失子宮內(nèi)膜樣腺癌中MLH1甲基化檢測結果Fig.3 MLH1 methylation was detected in sample with protein expression deletion

表1 MMR蛋白表達缺失與臨床病理學特征相關性Tab.1 Correlation between MMR protein expression loss and clinicopathological features

3 討 論

MMR系統(tǒng)主要包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6，能夠識別并糾正DNA錯配，修復DNA損傷，維持基因組的穩(wěn)定性［4］。微衛(wèi)星是包含1 ～ 4個堿基對的短串聯(lián)重復DNA序列，由于其重復結構，很容易發(fā)生復制錯誤，通常由MMR系統(tǒng)修復。MMR基因突變導致的dMMR可產(chǎn)生一種強突變表型，即MSI，MSI是發(fā)生在LS患者中的腫瘤典型的分子變化，其特征是簡單重復微衛(wèi)星序列的長度變化［5］，MSI會導致大多數(shù)LS的發(fā)生，與普通人群相比，LS患者的各種癌癥患病風險顯著增加，因此，篩查新發(fā)病例中的LS患者至關重要［7］。LS最根本的診斷依據(jù)是遺傳學基因突變檢測，然而，在實際臨床工作中，由于突變檢測價格昂貴、檢測費時等，臨床普及較困難。據(jù)研究統(tǒng)計，相較于基因檢測，利用IHC檢測具體蛋白表達缺失，提示某一個或者多個MMR基因突變的敏感性和特異性較高，為初步篩選LS患者的有效方法［8-9］。因此，本研究旨在通過IHC的方法探究MMR缺失與患者臨床病理學特征的相關性，為子宮內(nèi)膜癌的精準治療和預后預測提供新的啟示和理論基礎。

關于dMMR的發(fā)生頻率已有多項研究，其數(shù)據(jù)各不相同，這可能與各研究中收集的標本類型不同或地域差別有關。本研究中共有138例（26.8%）發(fā)生MMR蛋白表達缺失。低于Manchana等［10］報道的34.9%、晉薇等［11］報道的34.5%和Zhao等［12］報道的29.89%，高于文獻［13］報道的21.6%。本研究結果顯示，MMR蛋白表達缺失以MLH1和PMS2聯(lián)合表達缺失為主；其次為MSH2和MSH6聯(lián)合表達缺失；這與研究［10-11，14］報道的結果相同。MMR蛋白表達缺失率由高到低排序依次為PMS2、MLH1、MSH6、MSH2（缺失率分別為19.0%、16.3%、8.0%、5.4%）。其中PMS2缺失率最高，MSH6與MSH2的缺失率差異不顯著，這與晉薇等［11］報道的數(shù)據(jù)基本一致。值得注意的是，盡管MLH1基因缺失率較高，但其中不乏MLH1基因甲基化的患者，需進一步對標本進行MLH1基因甲基化檢 測。

目前，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生平均年齡約為60歲，但LS相關的子宮內(nèi)膜癌患者診斷時的平均年齡小于散發(fā)型患者［12］。此外，有研究［13］表明，不同突變體的發(fā)病年齡也不同：與MSH2或MLH1突變相比，MSH6突變者出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的年齡較晚，MSH6基因突變者子宮內(nèi)膜癌發(fā)病年齡為50.6 ～ 59.5歲，而MLH1和MSH2基因突變患者發(fā)病年齡為39.0 ～ 49.5歲，本研究結果顯示，與pMMR的子宮內(nèi)膜樣腺癌患者相比，dMMR患者發(fā)病年齡更小，究其原因，MMR缺失可能會使患者發(fā)病年齡提前，這將為制定個體化預防措施提供理論依據(jù)。另有研究［11］顯示，dMMR患者腫瘤組織更易浸潤深肌層，這與本研究結果（dMMR腫瘤患者腫瘤組織多無肌層浸潤）相悖，也有研究［14］表明錯配修復蛋白缺失的患者腫瘤浸潤深度通常小于1/2肌層，分析其原因，可能是由于不同研究人員臨床病理學數(shù)據(jù)和納入標準存在主觀差異、樣本量不同以及地域差異，因此，需要擴大病例數(shù)深入研究。

關于LS相關的FIGO臨床分期特征仍存在爭議。本研究結果顯示，dMMR患者FIGO分期Ⅲ ～ Ⅳ期更多見，呈現(xiàn)較高的臨床分期，且組織學分化程度多為低分化，提示預后不良。McMeekin等［15］認為MMR缺陷與預示不良預后的臨床特征（較高的腫瘤級別、淋巴血管間隙侵犯的存在及淋巴結轉(zhuǎn)移比例高）顯著相關，這與本研究MMR缺陷患者組織學分化程度多為低分化，多出現(xiàn)脈管、神經(jīng)侵犯及淋巴結轉(zhuǎn)移相似。綜上所述，就納入本研究的515例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者而言，其中MMR蛋白缺失的患者表現(xiàn)出獨特的臨床病理學特征，可推測MMR缺陷與預后不良的臨床特征（較高的腫瘤臨床FIGO分期、組織學分化程度多為低分化、脈管轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵犯及淋巴結轉(zhuǎn)移）相關，提示MMR蛋白缺失可能導致預后不良。另外，腫瘤浸潤淋巴細胞與患者臨床預后相關：一方面，腫瘤浸潤淋巴細胞可抑制腫瘤的生長和進展；另一方面，又可促進免疫抑制而幫助腫瘤細胞免疫逃逸，其最終發(fā)揮的效應，是其各個亞群在腫瘤免疫微環(huán)境中相互平衡博弈的結果［16］。McMeekin［15］和Shikama等［17］指出，盡管dMMR的患者臨床分期更高，淋巴血管間隙侵犯更多，但卻與良好的總體生存結局相關。他們認為，MMR缺陷可能會抵消以上不良預后的影響。本研究結果表明，腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤伴瘤周淋巴細胞在dMMR組中明顯高于pMMR組，因此，我們推測這可能將成為改善患者預后的因素。

研究［15］表明，MMR缺失的結直腸癌患者生存期有改善，但dMMR對子宮內(nèi)膜癌的預后影響尚無確切定論，也有研究［17］表明dMMR與患者不良預后相關或無差異，看來還需更多大規(guī)模的研究。另外，多數(shù)子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)現(xiàn)時為早期階段（FIGO分期Ⅰ或Ⅱ），因此，子宮內(nèi)膜樣腺癌患者復發(fā)的絕對風險很低，5年總生存率接近90%［18］。我們隨訪了515例患者，有49例失訪，僅有19例死亡，其中因子宮內(nèi)膜樣腺癌復發(fā)死亡的有15例，因此針對dMMR患者對子宮內(nèi)膜樣腺癌預后的影響還需要更長的隨訪時間才能得出結論，這也是本研究未來的方向之一。

2013年美國癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）項目將子宮內(nèi)膜癌劃分為4種分子亞型：POLE突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、低拷貝數(shù)型和高拷貝數(shù)型［19］。研究證實，不同分子特征可能導致輔助放化療敏感性差異，如p53基因突變型患者接受放化療比單純放療的5年無復發(fā)生存率明顯增高［20］，因此，TCGA分子分型能更準確地指導子宮內(nèi)膜癌患者術后治療及預測預后。TP53基因作為一種抑癌基因，涉及許多DNA修復機制，p53蛋白失活或異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。研究［21］表明，p53和MMR之間的關系似乎集中在MMR核心組分MSH2上。Cranston等［22］的研究顯示，p53和MMR在小鼠中協(xié)同發(fā)揮作用。另外，在體外，Subramanian等［23］證實MSH2 ～ MSH6復合物可以通過拓撲畸變增強p53與DNA底物的結合。目前鮮有關于MMR蛋白與p53蛋白表達的相關性研究，本研究結果表明，MSH6蛋白缺失患者多無p53異常表達，該結論仍需進一步深入研究。

研究表明，MMR表達缺失可導致腫瘤對多種傳統(tǒng)化療藥物的耐藥，如氟尿嘧啶類藥物、去甲基化藥物和鉑類藥物［24］。因此，對于治療dMMR的晚期和復發(fā)性子宮內(nèi)膜樣腺癌患者是一項重大的挑戰(zhàn)，臨床迫切需要新的有效的治療手段。輔助放療在MMR蛋白表達缺失的子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮更重要的作用，如Franchitto等［25］發(fā)表的MSH2缺陷細胞可能對輻射的敏感性有所增加。同樣，Reijnen等［26］研究顯示，輔助放療可提高dMMR患者的特異性生存率。dMMR的腫瘤患者表現(xiàn)為高水平的突變，導致MSI［27］。突變增加通常表現(xiàn)為新抗原，招募并激活宿主免疫細胞［28］。有研究［29］表明服用阿司匹林能夠降低結直腸癌及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風險。研究［30］表明，腫瘤可通過某些免疫檢查點途徑以達到免疫抵抗，免疫檢查點多數(shù)是由受體-配體作用而啟動的，例如腫瘤通過上調(diào)細胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1），PD-L1和T細胞上的程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）相互作用，從而抑制活化的T細胞介導的腫瘤細胞死亡。因此，激活或增強抗腫瘤免疫反應最有效的免疫干預措施之一是通過使用抗體來阻斷免疫檢查點。

本研究收集515例子宮內(nèi)膜樣腺癌，采用IHC檢測MMR蛋白表達情況，并且對MLH1表達缺失的標本進行MLH1基因甲基化檢測，以初步篩查出LS患者，對dMMR相關患者的臨床病理學特征進行探討，并對篩選適合免疫治療的患者提供依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。