甘冬英，周紅

高齡不孕女性生育力下降主要表現(xiàn)為卵巢儲(chǔ)備功能和卵子質(zhì)量降低。卵巢儲(chǔ)備功能降低表現(xiàn)為基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)減少、抗苗勒管激素水平下降及基礎(chǔ)卵泡刺激素（basic follicle-stimulating hormone，bFSH）水平升高等。卵子質(zhì)量降低表現(xiàn)為妊娠率下降、流產(chǎn)率增加等。因此，年齡相關(guān)性不孕已成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，但卵子衰老機(jī)制尚不明確。高齡女性生殖功能減退伴隨卵子微環(huán)境代謝物改變，涉及葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，影響卵子的發(fā)育、成熟、受精等[1]。因此，卵子微環(huán)境代謝組學(xué)分析可篩選出與卵子質(zhì)量及數(shù)量下降相關(guān)的代謝物，探索年齡相關(guān)生殖功能減退的實(shí)質(zhì)，為改善體外受精-胚胎移植結(jié)局提供理論依據(jù)。

1 糖代謝

糖是體內(nèi)的主要供能物質(zhì)，葡萄糖是卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complex，COC）產(chǎn)生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的重要代謝物。在COC中，葡萄糖的代謝途徑包括無(wú)氧氧化、有氧氧化、磷酸戊糖途徑、己糖胺生物合成途徑等。大部分葡萄糖通過(guò)有氧氧化途徑提供能量。磷酸戊糖途徑提供COC成熟過(guò)程中DNA合成所需的嘌呤、核酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等，為卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟提供底物。己糖胺生物合成途徑在細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張和O-連接蛋白糖基化過(guò)程中為透明質(zhì)酸的生成提供底物。因此，葡萄糖代謝在卵子成熟過(guò)程中起重要作用[2]。

1.1 糖的無(wú)氧氧化糖的無(wú)氧氧化分為糖酵解和乳酸生成2個(gè)階段。在COC中，由于卵子缺乏胰島素調(diào)節(jié)的高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和糖酵解的限速酶磷酸果聚糖酶，糖酵解幾乎全部在卵丘細(xì)胞中進(jìn)行。卵丘細(xì)胞代謝葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸和乳酸鹽等代謝物，這些分子通過(guò)縫隙連接輸送至卵子[2]。丙酮酸和乳酸是糖無(wú)氧氧化的重要代謝物，丙酮酸通過(guò)乳酸脫氫酶生成乳酸。對(duì)牛的大、小卵泡研究發(fā)現(xiàn)，小卵泡氧含量較低，葡萄糖快速代謝產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致卵泡液乳酸堆積，損害卵子發(fā)育[3]。采用高分辨率1H-核磁共振波譜對(duì)超過(guò)40歲和25～35歲的女性卵泡液進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)超過(guò)40歲女性的卵泡液葡萄糖水平降低，乳酸水平升高。這與卵巢顆粒細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸脫氫酶和磷酸果糖激酶基因表達(dá)增加有關(guān)[4]。高齡女性糖的無(wú)氧氧化增加，導(dǎo)致葡萄糖利用率下降，可能通過(guò)上調(diào)糖酵解的相關(guān)基因表達(dá)，增加線(xiàn)粒體自噬及促凋亡蛋白表達(dá)，從而降低卵子發(fā)育潛能[5]。

1.2 糖的有氧氧化卵子生長(zhǎng)過(guò)程中，卵丘細(xì)胞及卵子共同合作完成糖的有氧氧化。卵丘細(xì)胞產(chǎn)生丙酮酸輸送至卵子。丙酮酸在線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A通過(guò)三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈生成ATP（ATP生成的主要途徑）。卵子上調(diào)卵丘細(xì)胞的糖酵解基因以確保自身丙酮酸的需求。葡萄糖通過(guò)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化提供大量ATP，對(duì)卵泡正常生長(zhǎng)和發(fā)育是必不可少的[2]。隨著年齡增長(zhǎng)，女性機(jī)體抗氧化能力逐漸下降，活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積。卵子線(xiàn)粒體長(zhǎng)期暴露于ROS，線(xiàn)粒體突變和功能異常的可能性增加，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少，影響卵子質(zhì)量[6]。

高齡女性可補(bǔ)充脫氫表雄酮激活能量代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子活性，進(jìn)而調(diào)控下游生物發(fā)生相關(guān)基因，上調(diào)糖酵解基因表達(dá)，增加線(xiàn)粒體氧化磷酸化，增強(qiáng)細(xì)胞能量代謝。富含能量的細(xì)胞因衰老引起的程序性細(xì)胞死亡（如線(xiàn)粒體自噬、凋亡等）減少[7]。線(xiàn)粒體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輔酶Q10是一種隨著年齡增長(zhǎng)而下降的脂溶性電子轉(zhuǎn)移劑，給高齡小鼠補(bǔ)充輔酶Q10可延緩卵巢儲(chǔ)備減少，修復(fù)卵巢線(xiàn)粒體基因表達(dá)，提高線(xiàn)粒體活性[8]。雖然使用線(xiàn)粒體營(yíng)養(yǎng)素聽(tīng)起來(lái)很吸引人，但其臨床效果仍需進(jìn)一步研究。

1.3 磷酸戊糖途徑磷酸戊糖途徑是一條參與機(jī)體多種代謝反應(yīng)、多種物質(zhì)信息傳遞的代謝途徑，由氧化階段和基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)階段組成。磷酸戊糖途徑除了受葡萄糖-6-磷酸脫氫酶制約外，還受細(xì)胞內(nèi)NADPH的調(diào)節(jié)[9]。NADPH在6-磷酸葡萄糖氧化為6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯的過(guò)程中產(chǎn)生。NADPH為脂質(zhì)和氨基酸的合成提供供氫體，并且是卵子發(fā)育過(guò)程中的主要還原劑之一，如可用于維持谷胱甘肽（glutathione，GSH）的還原狀態(tài)[2]。在豬卵子體外成熟過(guò)程中，抑制磷酸戊糖途徑后NADPH減少，GSH水平顯著降低，ROS水平增加，這說(shuō)明磷酸戊糖途徑在維持高水平GSH和低水平ROS中發(fā)揮重要作用[5]。高齡小鼠卵子內(nèi)NADPH比年輕小鼠低[10]，這可能是高齡女性卵泡液磷酸戊糖途徑代謝異常導(dǎo)致GSH還原酶和過(guò)氧化氫酶水平下降的原因[11]。此外，磷酸戊糖途徑代謝物嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)減數(shù)分裂進(jìn)程，NADPH調(diào)節(jié)卵子促成熟因子活性，共同參與卵子成熟[5]。如果抑制磷酸戊糖途徑，則降低卵子質(zhì)量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低囊胚形成率[12]，這或許是高齡女性卵子非整倍體率增加的原因之一。

2 脂代謝

脂質(zhì)包括三酰甘油、膽固醇和磷脂等。三酰甘油儲(chǔ)存于卵子中，是卵子最豐富的脂質(zhì)之一，占脂質(zhì)的50%以上，是卵子巨大的能量?jī)?chǔ)備，用于線(xiàn)粒體β氧化產(chǎn)生能量。另外，膽固醇和磷脂的濃度是卵子受精后快速分裂形成膜的關(guān)鍵因素。因此，卵子微環(huán)境脂質(zhì)改變會(huì)影響卵子的能量代謝和發(fā)育[13]。

2.1 三酰甘油在排卵期間，卵子排出極體、顆粒細(xì)胞增殖、卵丘細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)等均是能量消耗的過(guò)程。三酰甘油通過(guò)脂肪動(dòng)員生成甘油及脂肪酸。卵子通過(guò)線(xiàn)粒體氧化游離脂肪酸，增加能量消耗，這是一種比糖代謝更有效的ATP來(lái)源，如一分子葡萄糖氧化產(chǎn)生30或32個(gè)ATP，而等量脂肪酸棕櫚酸酯氧化卻產(chǎn)生106個(gè)ATP。COC的游離脂肪酸來(lái)自卵泡液攝取或細(xì)胞脂質(zhì)分解，后經(jīng)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ進(jìn)入線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。經(jīng)β氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底氧化生成ATP，產(chǎn)生的還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)ADH2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）經(jīng)呼吸鏈氧化，與腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）磷酸化耦聯(lián)生成ATP[2]。如果卵泡液中游離脂肪酸過(guò)多，產(chǎn)生毒性，會(huì)導(dǎo)致COC形態(tài)發(fā)育不良，影響卵子的核成熟[14]。反之，如果游離脂肪酸過(guò)少，則β氧化底物不足，亦影響卵子發(fā)育潛能[15]。與體內(nèi)成熟的COC相比，體外成熟的卵子和卵丘細(xì)胞的β氧化水平均降低，可能體外培養(yǎng)的COC缺乏左旋肉堿，導(dǎo)致β氧化供能不足。哺乳動(dòng)物卵子質(zhì)量隨年齡增長(zhǎng)而下降，部分歸因于游離脂肪酸及與β氧化有關(guān)的酶水平的降低[16]。

高齡女性卵子體外培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充左旋肉堿可提高卵子發(fā)育潛能，特別是提高優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚形成率，增加健康新生兒出生數(shù)量。這是因?yàn)樽笮鈮A可增加線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子a和核呼吸因子1基因的表達(dá)，減少線(xiàn)粒體分布異常的卵子數(shù)，增加富含線(xiàn)粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的卵子數(shù)，增加超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）的表達(dá)，促進(jìn)游離脂肪酸β氧化，保護(hù)卵子免受游離脂肪酸的毒性，從而提高獲卵數(shù)和囊胚形成率[15,17]。

2.2 膽固醇卵巢中的膽固醇是類(lèi)固醇激素的合成前體，對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。卵丘細(xì)胞是卵子膽固醇的主要來(lái)源。卵子不能從乙酸酯合成膽固醇，也不能通過(guò)受體介導(dǎo)選擇性地?cái)z取膽固醇，因?yàn)楦呙芏戎鞍祝╤igh-density lipoprotein，HDL）受體[如B族Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）]、低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）及膽固醇生物合成途徑中的7種轉(zhuǎn)錄酶均不在卵子中表達(dá)，但在卵丘細(xì)胞中高表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)雖然卵泡液總膽固醇含量與年齡無(wú)關(guān)[19]，但高齡女性如21-羥基孕烯醇二硫酸酯、孕二醇-3-葡萄糖醛酸等類(lèi)固醇的生成減少，孕酮、17α-羥基孕酮含量增加，這可能是由于膽固醇代謝增加所致[20]，也可能是由于膽固醇反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)受膽固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白、FSH、LDLR及SR-B1等調(diào)控[18]。這些因素受膽固醇穩(wěn)態(tài)控制機(jī)制監(jiān)測(cè)，如當(dāng)類(lèi)固醇激素減少時(shí)，F(xiàn)SH增強(qiáng)卵丘細(xì)胞LDLR和SRB1的表達(dá)，進(jìn)而增加卵丘細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取[18]。HDL是卵泡液中膽固醇的主要脂蛋白，因血液-卵泡屏障存在，其他大分子脂蛋白如低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等在卵泡液中幾乎不存在[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，HDL代謝與卵子發(fā)育間存在復(fù)雜的相互作用。血液HDL水平與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)[21]，但在體外培養(yǎng)中，HDL濃度過(guò)高對(duì)胚胎質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[22]。蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法分析顯示，高齡女性卵泡液HDL比年輕女性低，且載脂蛋白A1和載脂蛋白CⅡ水平隨年齡增長(zhǎng)而降低，載脂蛋白E反而升高，這提示高齡女性膽固醇與載脂蛋白的相互作用及分布對(duì)生育力有一定影響[23]?？偟膩?lái)說(shuō)，與年齡相關(guān)的膽固醇代謝、調(diào)節(jié)及分布的改變，可能影響卵子質(zhì)量，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.3 磷脂作為生物膜的重要組成部分，磷脂分為甘油磷脂和鞘磷脂，在酶調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)運(yùn)中不可或缺。對(duì)35歲以上和35歲以下女性卵泡液脂質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，35歲以上女性的卵泡液一系列鞘磷脂類(lèi)、甘油磷脂類(lèi)等水平均發(fā)生顯著變化，提示鞘糖脂、甘油磷脂和磷脂酰肌醇磷酸可作為前瞻性脂質(zhì)生物標(biāo)志物[23]。一項(xiàng)關(guān)于小鼠MⅡ卵子的研究顯示，高齡小鼠卵子有26種磷脂類(lèi)下降，如磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸等，而過(guò)氧化氫處理過(guò)的年輕小鼠卵子有35種磷脂類(lèi)下降，二者下降的磷脂類(lèi)重復(fù)率很高，提示卵子膜磷脂是衰老過(guò)程中氧化應(yīng)激的靶點(diǎn)，高齡小鼠卵子膜的完整性與其受精和發(fā)育潛能密切相關(guān)[24]。另一項(xiàng)研究使用超高效液相色譜和高分辨率質(zhì)譜對(duì)年輕（28～34歲）及高齡女性（35～48歲）卵泡液進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有3種磷脂代謝物下調(diào)[LysoPC(16:1)、LysoPC(20:4)、LysoPC(20:3)]和2種磷脂代謝物上調(diào)[LysoPC(18:3)、LysoPC (18:1)]，且體外受精結(jié)局亦提示獲卵率、2PN卵裂率和可移植胚胎率隨年齡增長(zhǎng)而降低。提示溶血卵磷脂參與卵泡發(fā)育和卵子成熟的調(diào)節(jié)，其復(fù)雜的變化與卵泡發(fā)育密切相關(guān)[23]。

3 蛋白質(zhì)代謝

正常人卵泡液含有的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞進(jìn)程，如受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、補(bǔ)體激活等，涉及的生物學(xué)功能包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡等，與卵泡發(fā)育和卵子成熟密不可分。此外，這些蛋白質(zhì)在高齡女性及年輕女性中表現(xiàn)的差異性為與年齡有關(guān)的卵巢功能減退提供了生物學(xué)基礎(chǔ)[25]。

一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，年輕女性（20～32歲）與高齡女性（38～42歲）的卵泡液有19種蛋白存在差異，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，高齡組有5種蛋白質(zhì)（補(bǔ)體C3及C4、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血液結(jié)合素、激肽原）表達(dá)發(fā)生下調(diào)。其中，補(bǔ)體的活化可致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子缺乏，影響卵子成熟。而抗氧化蛋白血清轉(zhuǎn)鐵蛋白及血液結(jié)合素減少可致ROS過(guò)多而影響生育。激肽原促進(jìn)卵泡和黃體的生理性血管生成，年齡相關(guān)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)損傷可能是原始卵泡和卵巢間質(zhì)血管生成不足所致，導(dǎo)致卵子的質(zhì)量及數(shù)量降低[23]。另外，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)卵丘細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行檢測(cè)，鑒定出1 423個(gè)蛋白，其中110個(gè)在高齡女性（40～45歲）和年輕女性（20～33歲）中存在差異，62個(gè)蛋白豐度增加，48個(gè)蛋白豐度減少，主要涉及脂肪酸代謝、氧化磷酸化和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。參與脂肪酸代謝的蛋白表達(dá)增加，參與氧化磷酸化的蛋白和轉(zhuǎn)錄后RNA加工的蛋白表達(dá)減少[26]。因此，對(duì)卵子微環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)的認(rèn)識(shí)可加深對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程的理解，有利于卵子質(zhì)量評(píng)價(jià)，為臨床改善年齡相關(guān)的生育力減退提供新的干預(yù)措施。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的肽亞基。卵泡液和COC中關(guān)鍵氨基酸缺乏影響許多重要信號(hào)分子、受體和酶，進(jìn)而改變信號(hào)、代謝途徑及后續(xù)的卵子質(zhì)量。此外，氨基酸在卵子發(fā)育過(guò)程中獲得RNA轉(zhuǎn)錄信息，且參與DNA甲基化調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，如蛋氨酸通過(guò)形成S-腺苷蛋氨酸在DNA甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。

一項(xiàng)研究在卵泡液中鑒定出4種氨基酸，包括蛋氨酸、肌酸、組氨酸和反式-4-羥脯氨酸，且這4種氨基酸在高齡女性中的表達(dá)水平顯著高于年輕女性。其中蛋氨酸是同型半胱氨酸和肌酸的前體，同型半胱氨酸氧化產(chǎn)生自由基，對(duì)血管內(nèi)皮有毒性作用，可降低卵子成熟率。組氨酸具有血管生成和抗血管生成的特性，隨著年齡增長(zhǎng)，可能抗血管生成占優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而影響卵巢功能。反式-4-羥脯氨酸對(duì)卵巢作用的研究有限。年齡依賴(lài)性增加的蛋氨酸、組氨酸和反式-4-羥脯氨酸與卵子數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，可能是卵巢功能隨年齡增長(zhǎng)而下降的原因[20,28]。相反，有些氨基酸隨年齡增長(zhǎng)而下降，如D-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、脯氨酸。D-天冬氨酸可以誘導(dǎo)激素的生物合成和釋放，D-天冬氨酸水平越高，MⅡ卵子形態(tài)越好[23]。L-苯丙氨酸通過(guò)苯丙氨酸羥化酶參與神經(jīng)遞質(zhì)合成，其不足可影響下丘腦-垂體功能，對(duì)卵子發(fā)育不利[1]。脯氨酸保護(hù)膜和酶，清除自由基，作為鉀離子調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)滲透平衡，參與卵子的有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程[1]。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

高齡女性生育力下降的原因非常復(fù)雜，涉及到基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白以及代謝物等各個(gè)層面。卵子與局部微環(huán)境雙向?qū)υ?huà)，涉及葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸等，對(duì)卵子發(fā)育成熟、受精及后續(xù)胚胎發(fā)育具有重要作用。由于代謝物與卵子及胚胎發(fā)育潛能之間的確定關(guān)聯(lián)及具體機(jī)制尚不明晰，未來(lái)還需進(jìn)一步從卵子局部微環(huán)境代謝物改變的角度探討年齡相關(guān)性生育力下降的可能因素，以期揭示年齡相關(guān)性卵巢功能減退的內(nèi)在機(jī)制，為改善高齡女性助孕生育結(jié)局提供方法。