徐春暉，王遠(yuǎn)興

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

綠茶屬于“非發(fā)酵”型茶葉，干燥和蒸制鮮葉使多酚氧化酶失活，因此含有較低的兒茶素氧化水平（＜1%），相比紅茶和龍井茶（兒茶素氧化水平在5%～16%之間）含有更多的兒茶素[1]。此外富含礦物質(zhì)、維生素、咖啡因和茶多酚等成分，具有降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、抗癌、抗纖維化特性和神經(jīng)保護(hù)能力等健康益處[2--3]，是現(xiàn)今世界上最為廣泛流行的飲料之一[4]。

狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶是江西省的優(yōu)質(zhì)名茶，生長地區(qū)山高林密、土質(zhì)肥沃、雨量充沛，生長茶樹的芽葉持嫩性強(qiáng)，氨基酸、咖啡堿、芳香物質(zhì)等含量豐富，制作出的綠茶滋味醇厚鮮爽，湯色碧綠澄明，色澤翠綠光潤，受到茶葉愛好者的廣泛青睞，現(xiàn)已成為當(dāng)?shù)氐乩順?biāo)志性產(chǎn)品[5]。目前，名優(yōu)茶價(jià)值高，市場占有份額較大，利益豐厚，使得一些不法商家將劣質(zhì)茶葉貼上名優(yōu)茶的標(biāo)簽以高價(jià)出售從而獲取高價(jià)利潤[6]，這不僅造成了茶葉市場的混亂，也對(duì)茶農(nóng)的利益以及名茶的名譽(yù)造成了損害[7]。目前茶葉的檢測，只針對(duì)茶葉的主要成分，如兒茶素或其他元素的檢測，這種方法局限性強(qiáng)，不能全面地反映出茶葉中的代謝物情況；或是依賴于品茶師的感官鑒定，這種人為方法主觀性較強(qiáng)，不具有說服力，缺乏科學(xué)客觀的量化依據(jù)和精確描述[8]。因此，為保護(hù)江西名茶這一寶貴市場，需要對(duì)其真實(shí)性進(jìn)行控制，建立一種客觀準(zhǔn)確的茶葉品質(zhì)鑒定方法以打擊假冒偽劣產(chǎn)品和保證江西名茶的品質(zhì)意義重大。

非靶向代謝組學(xué)是針對(duì)生物系統(tǒng)內(nèi)小分子代謝物（＜1 000 Da）全面、系統(tǒng)的定性和定量分析[9]，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)不僅可以可視化分析樣本間的差異，還能尋找潛在差異代謝物[10]。探究不同外界因素影響下代謝物水平的變化，例如茶葉體內(nèi)代謝物通常會(huì)受季節(jié)、氣候條件、土壤、肥料、遮陽和地理位置等因素影響，從而導(dǎo)致茶葉的質(zhì)量和市場價(jià)值產(chǎn)生差異[11-13]。在過去十幾年里，非靶向代謝組學(xué)結(jié)合各種分析方法評(píng)估代謝物水平與外界因素之間的關(guān)系，如核磁共振、近紅外光譜或基于質(zhì)譜的平臺(tái)。與其他代謝組學(xué)平臺(tái)相比，超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）具有明顯的優(yōu)勢，分辨率、靈敏度和峰重現(xiàn)性更高，并允許同時(shí)對(duì)多個(gè)化合物進(jìn)行快速的定性或相對(duì)定量分析[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)在研究狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上[5]，使用UPLC-QTOF-MS結(jié)合非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行全面高覆蓋檢測分析，探究3種江西名優(yōu)綠茶間的差異并篩選潛在差異物。構(gòu)建預(yù)測模型對(duì)狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶品質(zhì)進(jìn)行鑒別，為保護(hù)這3種江西名茶提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狗牯腦（26個(gè)批次）由遂川縣湯湖鎮(zhèn)遂川之寶生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供；廬山云霧茶（25個(gè)批次）產(chǎn)于江西省九江市廬山茶科所茶場；婺源綠茶（25個(gè)批次）由婺源縣婺康源有限公司提供；市場茶樣（22個(gè)批次）購于茶葉交易市場和淘寶電商平臺(tái)。采集時(shí)間為2020年5月，所有茶葉樣品置于密封袋中并在4 ℃冰箱中保存。

蒸餾水 屈臣氏食品飲料有限公司；乙腈（色譜級(jí)） 德國Merck公司；甲酸 美國ROE公司；甲醇（分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 UPLC儀-6538 QTOF-MS儀（配有MassHunter Qualitative Analysis和MassHunter Mass Profiler數(shù)據(jù)處理軟件） 美國安捷倫公司；AL-104電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；TDL-5-A離心機(jī) 北京東方精華苑科技有限公司；KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備

將茶葉樣本（去除莖干）磨成細(xì)粉，過0.425 mm篩。準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品于10 mL離心管，加入6 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，室溫下超聲1 h，隨后以4 800 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm PTFE濾膜于2 mL棕色螺旋進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)檢測[16]。

從每個(gè)樣品吸取50 μL混合制成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本。在樣品序列分析開始前，將QC樣品連續(xù)注入10 次以平衡系統(tǒng)，確保所收集數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，然后在整個(gè)分析過程中定期進(jìn)行QC樣品分析（每隔5個(gè)茶葉樣本），以監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性[17]。同時(shí)，在QC樣本分析后，注入空白樣品（甲醇-水（70∶30，V/V）），以減少序列分析過程中的殘留效應(yīng)[18]。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量3 μL；梯度洗脫：0～25 min，98%～75% A、2%～25% B；25～35 min，75%～25% A、25%～75% B；后運(yùn)行時(shí)間2 min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

模式：負(fù)離子模式；電子電離：電噴霧電離；干燥氣（N2）溫度325 ℃；干燥氣流速10.0 L/min；霧化器壓力40 psig；毛細(xì)電壓3 500 V；碰撞電壓175 V；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 700；二級(jí)碰撞能10～50 eV；參比離子：m/z112.985 587、1 033.988 109。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.0 4.00軟件將UPLC-QTOF-MS采集的原始數(shù)據(jù)文件（.d）通過“按分子特征查找化合物”功能進(jìn)行解卷積，參數(shù)如下：峰過濾器-峰高（輪廓和質(zhì)心質(zhì)譜圖）：≥100 counts；離子種類-負(fù)離子：-H、+HCOO、+CH3COO；峰高-相對(duì)峰高：≥2.5%；質(zhì)量過濾器：m/z112.985 587、1033.988 109。解卷積后將文件導(dǎo)出轉(zhuǎn)換為.cef文件，導(dǎo)入到MPP（MassHunter Mass Profiler）軟件中。MPP作為化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件，可用于數(shù)據(jù)對(duì)齊、歸一化和過濾，以篩選在狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶中具有顯著差異貢獻(xiàn)的特征化合物。隨后，將特征化合物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）以及熱圖分析，這些方法在之前研究中證明是可行的[19]。采用MPP軟件進(jìn)行PCA和PLS-DA，聚類分析和熱圖分別采用metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca）和TBtools軟件[20]繪制。

特征化合物通過準(zhǔn)確質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜圖、標(biāo)準(zhǔn)品以及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫Massbank（https://massbank.eu/MassBank/）、ChemSpider（http://www.chemspider.com/）、Metlin（http://metlin.scripps.edu）和文獻(xiàn)[21-26]鑒定差異代謝物[27-28]。

2 結(jié)果與分析

選擇狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶3種江西名茶作為實(shí)驗(yàn)樣本，探討不同江西名茶之間的代謝物差異。為保證茶葉來源的真實(shí)性，所有茶葉樣本均采集于當(dāng)?shù)夭鑸@。狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的總離子流圖如圖1所示。

圖1 狗牯腦（A）、廬山云霧茶（B）和婺源綠茶（C）的UPLC-QTOF-MS總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of UPLC-QTOF-MS of Gougunao tea (A), Lu Mountain Clouds-Mist tea (B) and Wuyuan green tea (C)

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

獲得高質(zhì)量和可靠的數(shù)據(jù)是非靶向代謝組學(xué)研究的主要前提。本研究對(duì)樣品分析方法的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的可靠性進(jìn)行監(jiān)測：從QC樣本中隨機(jī)挑選m/z345.081 54（3.312 min，為保留時(shí)間，下同）、195.087 12（9.266 min）、459.092 2（13.107 min）、757.219 86（18.188 min）、922.009 8（23.576 min）、1 274.273 92（32.396 min）6個(gè)特征離子，計(jì)算離子峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD），評(píng)估分析方法和儀器的重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，保留時(shí)間的RSD為0.03%～0.35%，峰面積的RSD為2.90%～6.07%。此結(jié)果表明儀器具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，所采集的數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步研究與分析。本研究認(rèn)為通過多元數(shù)據(jù)分析造成的數(shù)據(jù)誤差是由樣本本身代謝物差異造成的，而非系統(tǒng)或分析造成的誤差。

2.2 數(shù)據(jù)挖掘與預(yù)處理

采用UPLC-QTOF-MS對(duì)3種茶葉的代謝物在負(fù)離子模式下進(jìn)行高覆蓋檢測和分析，共檢測到2 994個(gè)代謝物。為去除無效且低濃度的代謝物，具體處理參數(shù)為：保留時(shí)間范圍0～35 min；最小絕對(duì)豐度為5 000 counts；對(duì)齊參數(shù)RT Window＝0.0%+0.15 min，Mass Window＝10×106+2.0 mDa；以所有樣品的中位數(shù)為基準(zhǔn)線。

為獲取狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶間的差異代謝物，設(shè)置以下過濾參數(shù)：1）按標(biāo)志過濾，保留在76個(gè)樣品中至少在2個(gè)樣品中出現(xiàn)的代謝物，以此排除“一次命中”的化合物，即該代謝物僅在1個(gè)樣品中出現(xiàn)，其對(duì)于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析沒有實(shí)質(zhì)性意義；2）按頻率過濾，保留在所有樣品中至少出現(xiàn)80%以上的代謝物；3）按樣品變異性過濾，保留變異系數(shù)小于25%的代謝物；4）按顯著性分析過濾，包括單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和倍數(shù)分析（fold change，F(xiàn)C）。采用ANOVA計(jì)算P值，使用Benjamini Hochberg進(jìn)行多重測試校正，Tukey HSD作為事后檢驗(yàn)，以P＜0.5為閾值；計(jì)算狗牯腦與廬山云霧茶、廬山云霧茶與婺源綠茶或狗牯腦與婺源綠茶（反之亦然）之間的FC值，以FC≥2為閾值[29]。如圖2所示，經(jīng)過以上參數(shù)設(shè)置進(jìn)行逐步過濾，原始代謝物的數(shù)量明顯減少，最終篩選出221個(gè)差異代謝物。

圖2 采用MPP對(duì)狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾得到差異代謝物Fig. 2 Data filtration to identify characteristic differential metabolites among Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea by using MPP analysis

為驗(yàn)證最終篩選出的差異代謝物的真實(shí)性和避免假陽性，利用遞歸特征提取[30]，從原始數(shù)據(jù)中自動(dòng)提取221個(gè)差異代謝物。檢驗(yàn)核對(duì)生成的提取化合物色譜圖，發(fā)現(xiàn)僅有1個(gè)假陽性（2個(gè)相同的差異代謝物），將其移除，故最終篩選出220 個(gè)差異性代謝物。

2.3 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1 PCA

在上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，對(duì)220 個(gè)差異代謝物進(jìn)行PCA，對(duì)狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的差異情況進(jìn)行總體概覽。從圖3可以看出，前2個(gè)PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)80%，這說明前2個(gè)PC可以解釋80%的全部信息，該P(yáng)CA可為鑒別3種江西名茶差異提供足夠的可信度。3種江西名茶根據(jù)類別分別被投影為不同顏色的小球，狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶明顯聚為3 組，基本得到了有效區(qū)分，說明這3種茶葉的代謝物在種類和相對(duì)含量上存在明顯差異。

圖3 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶PCA三維得分圖Fig. 3 PCA score plot of Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

2.3.2 聚類分析

根據(jù)各組代謝物豐度的相似性對(duì)樣品進(jìn)行聚類，聚類分析結(jié)果如圖4所示，狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶三者明顯被區(qū)分開，這與PCA結(jié)果相對(duì)應(yīng)。狗牯腦與廬山云霧茶距離較近，距離婺源綠茶較遠(yuǎn)，說明狗牯腦與廬山云霧茶的代謝物質(zhì)相近，與婺源綠茶代謝物質(zhì)差異較大。在同一大類中，由于茶樹品種、氣候和加工制作方法等因素的不同又分成了不同小類，代謝物質(zhì)相近的茶葉在樹狀圖中相距較近，該結(jié)果與之前研究狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶之間的揮發(fā)性成分結(jié)果一致[5]。

圖4 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的聚類樹狀圖Fig. 4 Hierarchical cluster analysis of Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

2.3.3 PLS-DA構(gòu)建分類模型

為證明上述數(shù)據(jù)提供的判別潛力，利用MPP構(gòu)建PLS-DA模型，PLS-DA是一種廣泛使用的監(jiān)督模式識(shí)別方法，能夠驗(yàn)證3種江西名茶分類結(jié)果以及預(yù)測茶葉的類別。如圖5所示，本研究的PLS-DA模型由每個(gè)真實(shí)的江西名茶構(gòu)建，3種茶葉具有良好的分類。在預(yù)測之前，首先對(duì)該模型進(jìn)行訓(xùn)練，判斷模型的準(zhǔn)確度，如表1所示，準(zhǔn)確度均為100%，說明該模型準(zhǔn)確度高，可用于下一步的樣本預(yù)測[31]。為了證明該模型的預(yù)測能力，除用于尋找特征差異物和建立分類模型的76 種江西名茶樣品之外，又在當(dāng)?shù)厥占? 種江西名茶，并另外在市面購買22 種茶葉樣品。這29種樣本在未告知分類的情況下，導(dǎo)入PLS-DA模型進(jìn)行預(yù)測，模型預(yù)測結(jié)果與實(shí)際樣本分類結(jié)果一致，準(zhǔn)確度為100%。這些結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的PLS-DA模型具有良好的預(yù)測能力，能夠?qū)逢裟X、廬山云霧茶和婺源綠茶進(jìn)行正確分類，可用于對(duì)市面上3種江西名茶進(jìn)行真?zhèn)闻袆e。

表1 使用PLS-DA預(yù)測模型的分類結(jié)果Table 1 Results of classification using PLS-DA model

圖5 狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶的PLS-DA得分圖Fig. 5 PLS-DA score plot of Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

2.4 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶特征差異代謝物鑒定

QTOF-MS儀中的四極桿和碰撞池以及TOF可以提供精確的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，用于鑒定差異代謝物。例如，在本實(shí)驗(yàn)中，基于一級(jí)母離子和二級(jí)碎片離子信息鑒定m/z441.080 7、保留時(shí)間17.899 min的特征差異物。如圖6所示，在碰撞能為20 eV的狀態(tài)下母離子被轟擊碎裂為二級(jí)碎片，僅有2個(gè)片段離子（m/z169.013 7、289.072 9）與母離子具有相同的保留時(shí)間和洗脫譜。在分子式估計(jì)過程中，根據(jù)未知化合物的同位素模式，只使用C（n≤40）、H（n≤100）、N（n≤20）、O（n≤30）、P（n≤15）和S（n≤5），不考慮Br、Cl、I和F，因?yàn)檫@些元素在茶葉化合物中發(fā)生的概率相當(dāng)?shù)汀Ｒ再|(zhì)量誤差（Δm/z≤5×106）為閾值，根據(jù)上述設(shè)置條件，MassHunter Qualitative Analysis為母離子m/z441.080 7生成56 種潛在分子式，為碎片離子m/z169.013 7、289.072 9分別提供6個(gè)和18個(gè)潛在分子式。在這兩種情況下，Qualitative Analysis軟件對(duì)生成的分子式進(jìn)行分?jǐn)?shù)評(píng)估（在0～100之間）。分子式的評(píng)分根據(jù)測量質(zhì)量與精確質(zhì)量、同位素豐度與預(yù)測豐度的比較，以及同位素間距與預(yù)測間距的比較，而不僅僅依賴于精確的質(zhì)量測量。最終評(píng)分從高至低進(jìn)行排序，得分最高的分子式很有可能是正確的分子式。通過這種方式，最終選定4個(gè)候選分子式（分子式評(píng)分大于85.0）：C22H18O10、C20H16N3O9、C19H10N10O4、C18H14N6O8。使用Metlin等在線數(shù)據(jù)庫對(duì)上述候選分子式進(jìn)行搜索，并與二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)上述成分只有1 種陽性，即為表兒茶素-3-O-沒食子酸酯（C22H18O10），這是一種存在于綠茶中的黃酮類（黃酮-3-醇）物質(zhì)。碎片離子m/z169.013 7 [M-C15H13O6]和m/z289.072 9 [M-C7H5O5]對(duì)應(yīng)的離子片段分別是去質(zhì)子化的兒茶素（或表兒茶素）和沒食子酸[22]。

圖6 表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 6 Secondary mass spectrum of (-)-epicatechin gallate

通過以上鑒定方法，從3種茶葉樣品中共鑒定出22 種特征差異代謝物，結(jié)果見表2。將相對(duì)含量經(jīng)MPP歸一化處理后導(dǎo)入到TBtools軟件中，再經(jīng)過scale處理繪制熱圖，圖7顯示了狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶中的含量差異。

表2 狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶中22 種特征差異代謝物Table 2 Twenty-two characteristic differential metabolites among Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

續(xù)表2

圖7 狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶中22 種特征差異代謝物含量的熱圖Fig. 7 Heatmap analysis of 22 characteristic differential metabolites among Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

3 結(jié) 論

通過UPLC-QTOF-MS建立一種狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶品質(zhì)鑒別的非靶向代謝組學(xué)分析方法，結(jié)果表明非靶向代謝組學(xué)研究在分析茶葉等復(fù)雜食品時(shí)是一種有價(jià)值的工具。使用MassHunter Qualitative Analysis和MPP進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘、篩選，最終確定狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶中220 個(gè)特征差異代謝物，使用這些差異物進(jìn)行可視化差異分析包括PCA和聚類分析，以及PLS-DA預(yù)測模型對(duì)3種茶葉依據(jù)品質(zhì)進(jìn)行分類。該預(yù)測模型基于當(dāng)?shù)貜V泛收集的真實(shí)樣本建立，并對(duì)市面上的茶葉進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明其總體準(zhǔn)確率達(dá)到100%，預(yù)測準(zhǔn)確。該模型可應(yīng)用于3種江西名茶品質(zhì)的真?zhèn)闻袆e，替代繁瑣且主觀的感官評(píng)價(jià)，為打擊假冒偽劣產(chǎn)品和保護(hù)正宗的江西名茶提供一定的理論依據(jù)和指導(dǎo)意義。同時(shí)，可見將UPLC-QTOF-MS應(yīng)用于食品代謝組學(xué)的鑒定和其他目的是非常可行的科學(xué)方法。