孫 銘，古其會，張菊梅，郭偉鵬，吳慧清，張友雄，韋獻虎，吳清平,*

（1.中國科學院廣州化學研究所，廣東 廣州 510650；2.廣東省科學院微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東 廣州 510070；3.中國科學院大學，北京 100049）

亞硝胺具有“三致”毒性，是水中一類新型含氮消毒副產物，近年來以N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）為主的N-亞硝胺類消毒副產物在世界各地的水環(huán)境中（飲用水廠、污水處理廠等）頻繁檢測出[1-4]。飲用水作為食品飲料工業(yè)的重要原料，其安全性直接關系著食品飲料行業(yè)的健康發(fā)展。因此，檢測飲用水中痕量N-亞硝胺，對評價飲用水水質，保證食品飲料水源的安全具有重要意義。

飲用水中N-亞硝胺的含量通常較低，因此在檢測前需要進行濃縮以降低方法檢出限，提高靈敏度，常用的方法主要有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[5]、固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）法[6]和固相萃取法[7-8]。其中，LLE需要大量有機溶劑，耗時費力。SPME雖然所需水樣少，省時，但容易受到環(huán)境及操作條件的影響，而且對低揮發(fā)性的N-亞硝胺回收率和靈敏度較低，僅適用于廢水中N-亞硝胺的檢測[9]。而固相萃取能同時萃取多種不同性質低濃度的目標物質，可對大體積樣品進行萃取，具有溶劑用量少，濃縮倍數(shù)高等優(yōu)點[9]。此外，固相萃取還能克服LLE在復雜基質樣品中易乳化的缺點[9]。

氣相色譜-質譜聯(lián)用[10-13]和氣相色譜結合熱能分析儀[14]已用于分析N-亞硝胺類物質，但主要用于分析揮發(fā)性和熱穩(wěn)定的N-亞硝胺[15-16]。采用帶紫外熒光檢測器的液相色譜和毛細管電泳方法檢測N-亞硝胺也有報道，但靈敏度低，無法滿足飲用水中痕量N-亞硝胺的檢測需求[17]。已有文獻報道[3,18-19]采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）的液相色譜-串聯(lián)質譜方法能同時檢測出飲用水中9種N-亞硝胺類消毒副產物，包括NDMA、亞硝基甲基乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、亞硝基嗎啡（N-nitrosomorpholine，NMOR）、亞硝基二丙胺（N-nitrosodi-n-propylamine，NDPA）、亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、亞硝基二丁胺（N-nitrosodi-n-butylamine，NDBA）、亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPhA）。但N-亞硝胺中的NDMA、NMEA和NDEA分子質量較小，ESI對于這3種物質的檢測靈敏度相比于其他6 種偏低，具有一定的局限性。利用大氣壓化學電離（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源對食品中小分子農藥殘留[20]和功能物質[21]的檢測已取得顯著效果，但在N-亞硝胺的液相色譜-質譜檢測方法中鮮見采用APCI離子源進行分析[22]。

本實驗采用固相萃取法對樣品進行前處理，并考察流動相、洗脫劑及定容溶劑對9種N-亞硝胺類消毒副產物響應強度的影響。優(yōu)化樣品前處理及進樣條件，采用APCI離子源，建立一種基于超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀同時檢測飲用水中9種N-亞硝胺的方法。本實驗通過檢測實際水樣中的痕量N-亞硝胺，驗證該方法的適用性，對于評價飲用水水質，進一步研究去除和控制飲用水中N-亞硝胺，保證食品飲料生產中飲用水安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CNW椰殼活性炭固相萃取小柱（2 g/6 mL） 上海安譜實驗科技股份有限公司；SB-C18RRHD色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） Agilent Technologies（上海）公司。

9種N-亞硝胺混標（2 000 mg/L甲醇溶液） 美國Supelco公司；NDMA-D6標準品（1 000 mg/L甲醇溶液）、NDPA-D14標準品（1 000 mg/L二氯甲烷溶液）美國O2si公司；二氯甲烷、甲醇、甲苯、乙腈、甲酸（均為色譜純） Agilent Technologies（上海）公司；碳酸氫鈉、乙酸銨、硫代硫酸鈉、碳酸氫銨（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司；高純氮氣（純度＞99.9%）廣州市君多氣體有限公司；水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

ExionLC AD /Triple Quad 5500+QTRAP超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀 美國SCIEX公司；HSE-12D固相萃取裝置（配真空泵） 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；MTN-2800D氮吹儀 天津奧特賽恩斯公司。

1.3 方法

1.3.1N-亞硝胺及內標標準溶液的配制

以甲醇為溶劑，采用購買的標準品梯度稀釋得到9種N-亞硝胺及NDMA-D6的混合標準溶液，質量濃度依次為1、2、5、10、20、50、100 μg/L，另外，NDPA-D14作為定量內標，其質量濃度為20 μg/L。

1.3.2 實際水樣的采集

取東江某水廠水源水及其供應區(qū)域內的管網水水樣。針對管網水進行采集的過程中，將質量濃度為100 mg/L的硫代硫酸鈉提前加入到棕色的采樣瓶中，以脫去管網水中的余氯。采取的水樣需在低溫、避光條件下運回實驗室，2 周內完成分析。

1.3.3 樣品處理

采用固相萃取法對樣本進行處理，在使用固相萃取小柱萃取之前，依次用6 mL二氯甲烷、12 mL甲醇和超純水15 mL活化小柱。水樣的pH值用碳酸氫鈉將其調節(jié)至8.0左右，500 mL水樣以3～5 mL/min的速率通過活化后的小柱。水樣上樣完后，在低壓下抽60 min。最后，使用二氯甲烷3×5 mL完成洗脫，洗脫過程中的實際流速應控制在2～3 mL/min范圍內，利用氮吹實現(xiàn)洗脫液的濃縮處理之后，向其中加入超純水定容至0.5 mL，以備進樣。

1.3.4 儀器檢測

液相色譜條件：SB-C18RRHD色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相由含有0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氫銨溶液（流動相A）和甲醇（流動相B）組成，流速0.4 mL/min，進樣量20 μL，柱溫40 ℃。流動相梯度洗脫程序：0～0.5 min，85% A、15% B；0.5～2.5 min，85%～5% A、15%～95% B；2.5～3.5 min，5% A、95% B；3.5～3.51 min，5%～85% A、95%～15% B；3.51～6.0 min，85% A、15% B。

質譜條件：采用APCI正離子多反應監(jiān)測模式檢測。氣簾氣壓力30 psi；離子化電流3 μA；離子源溫度350 ℃；噴霧氣壓力40 psi。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用高質量濃度（1 mg/L）的混標溶液，進行質譜條件的優(yōu)化，在全掃模式下確定待測物的母離子和最優(yōu)去簇電壓，然后在子離子模式下確定定量和定性子離子及對應的最優(yōu)碰撞能量。優(yōu)化得到9種N-亞硝胺及回收率標準物質（NDMA-D6）和定量內標（NDPA-D14）的質譜參數(shù)，結果如表1所示。

表1 9種N-亞硝胺及內標的質譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of nine N-nitrosamines and internal standard

2.2 流動相的選擇

以含0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氫銨溶液和甲醇作為流動相時樣品檢測強度為100%，根據(jù)不同流動相條件下相對強度確定最佳流動相。如圖1所示，當水-甲醇作為流動相時，NDMA、NMEA和NDEA的相對強度值小于50%，說明采用該流動相，NDMA、NMEA和NDEA的響應較差。同樣，當采用0.2%甲酸-甲醇作為流動相時，NMEA、NPYR和NDEA的響應較差；采用含0.2%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇作為流動相時，NDMA、NMEA和NDBA的響應較差。因此，要保證9種N-亞硝胺都能夠有較好的響應，在4 種流動相中甲醇和含有0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氫銨溶液作為流動相是最佳選擇。

圖1 流動相對9種N-亞硝胺相對強度的影響Fig. 1 Influence of mobile phase composition on relative intensities of nine nitrosamines

2.3 固相萃取材料的選擇

已有報道[23]不經過濃縮預處理直接進樣檢測水中N-亞硝胺，但通常方法檢出限為μg/L級別，而飲用水中N-亞硝胺質量濃度通常為ng/L級別，另外檢測水源水時，直接進樣會受到水體復雜基質的干擾，因此需要進行凈化、濃縮后進樣，才能滿足實際飲用水的檢測要求。固相萃取是常用于飲用水中N-亞硝胺的預濃縮方法，據(jù)文獻[7,19,22]報道，相比其他填料（HLB、Ambersorb572）的固相萃取小柱，EPA521推薦的椰殼活性炭小柱保留效果較好，因此本實驗選擇椰殼活性炭作為固相萃取材料。

2.4 洗脫溶劑的選擇

最終的洗脫溶劑應該充分結合被檢測物質的實際回收率進行確定。實驗分別使用二氯甲烷、甲醇和甲苯作為洗脫溶劑，測定其對9種N-亞硝胺的回收率影響，結果如圖2所示。二氯甲烷對9種N-亞硝胺的回收率均較高，所以選擇二氯甲烷作為本研究的洗脫劑。

圖2 洗脫劑對9種N-亞硝胺回收率的影響Fig. 2 Influence of eluents on recoveries of nine nitrosamines

2.5 定容溶劑的選擇

檢測不同定容溶劑條件下9種N-亞硝胺的相對強度，結果如圖3所示。當定容溶劑選擇乙腈的情況下響應最差，甲醇和乙腈利于NDBA的響應，二氯甲烷利于NDPhA的響應，而超純水作為定溶溶劑能夠讓其中絕大多數(shù)N-亞硝胺表現(xiàn)出較高的響應強度。因此，在本研究中選擇超純水作為最終定容溶劑。

圖3 定容溶劑對9種N-亞硝胺相對強度的影響Fig. 3 Influence of reconstitution solvents on relative intensities of nine nitrosamines

2.6 實驗方法評價

2.6.1 標準曲線繪制

采用內標法定量，結果如表2所示，9種N-亞硝胺及NDMA-D6在0～100 ng/L質量濃度范圍內表現(xiàn)出良好線性關系，并且其相關系數(shù)在0.996 9～0.999 5之間。根據(jù)3 倍信噪比對應的質量濃度確定檢出限，在0.10～0.33 ng/L之間。相關報道[7,24]采用ESI離子源進行液相色譜-質譜檢測水中9種N-亞硝胺時，對其中NDMA、NDEA和NMEA這些分子質量較小的N-亞硝胺檢出限較低，通常為ng/L，而相關報道[22]采用APCI離子源進行液相色譜-質譜檢測N-亞硝胺時，這些分子質量較小的N-亞硝胺檢出限也為1 ng/L，本實驗中NDMA、NDEA和NMEA的檢出限降低到0.15～0.33 ng/L，低于1 ng/L，相比之前報道的靈敏度更高，利于檢出水中更低含量的N-亞硝胺。本實驗采用的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法，與之前報道的氣相色譜-串聯(lián)質譜[25]和液相色譜-串聯(lián)質譜[26]相比，具有檢測時間短的優(yōu)點，可以在6 min內同時檢測水中9種N-亞硝胺。

表2 9種N-亞硝胺的線性方程及其檢出限和定量限Table 2 Linear equations and limits of detection and quantification of nine N-nitrosamines

2.6.2 回收率和精密度的測定

9種N-亞硝胺在源水和管網水中分別加標10 ng/L和50 ng/L時的回收率結果見表3。除在加標質量濃度為10 ng/L時，NDPhA的回收率在70%以下，其余回收率均在70%～130%范圍內，滿足EPA521的要求，無明顯基質效應。相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均不大于10%，精密度良好。說明本方法的適用性較好，可以滿足實際水體中N-亞硝胺的檢測要求。

表3 9種N-亞硝胺的加標回收率及RSDTable 3 Recoveries and relative standard deviations of nine N-nitrosamines in spiked samples

2.7 飲用水的檢測

為了驗證本方法對實際飲用水中9種N-亞硝胺的有效性和適用性，選擇珠江支流東江某水廠水源水（S1～S7）及其供水區(qū)域內管網水（T1～T7）進行污染調查，測定水樣中9種N-亞硝胺類化合物含量，結果如表4所示，9種N-亞硝胺類消毒副產物在源水（S4、S5和S6）3個水樣和管網水（T2、T3、T4和T6）4個水樣，共7個水樣中檢測出N-亞硝胺。共有5 種N-亞硝胺被檢出，分別為NDMA、NDEA、NMOR、NDPA和NDBA，其中NDMA的被檢出頻率最高，每個被檢出的水樣中都含有NDMA，其質量濃度為0.6～5.4 ng/L，這與相關全國性調查結果[27-29]類似。被檢出的N-亞硝胺中NDBA的質量濃度最高，Chen Yingjie等[30]在針對長江中下游流域開展調查的過程中也得出了相類似的結論。之前大部分研究主要集中于N-亞硝胺中的NDMA[31-34]，而忽視了除NDMA以外的N-亞硝胺的危害，根據(jù)調查的結果可知以后需對NDBA給予更多的關注。

表4 實際水樣檢測結果Table 4 Results of determination of nine N-nitrosamines in actual water samples ng/L

3 結 論

本研究采用固相萃取法進行前處理，以APCI為離子源，建立水中9種N-亞硝胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。與現(xiàn)有N-亞硝胺檢測研究相比，本方法具有靈敏度高、檢測速度快、適用性好的優(yōu)點，能夠滿足飲用水中N-亞硝胺的檢測需求。該方法的建立可以為系統(tǒng)性識別和評估食品飲料生產中N-亞硝胺的風險提供幫助。