毛永強(qiáng)，贠建民，趙風(fēng)云，艾對元，張紊瑋，何 奎，王 睿，武淑娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

臘肉制品作為中國典型的發(fā)酵肉制品，以其醇厚、鮮美的風(fēng)味，深受廣大民眾的喜愛。但在其生產(chǎn)過程中依然面臨著生產(chǎn)周期長、加工難度大、安全穩(wěn)定性差、風(fēng)味難以調(diào)控等難題[1]。目前關(guān)于臘肉加工工藝改進(jìn)和風(fēng)味控制還缺乏系統(tǒng)研究。風(fēng)味是臘肉制品整體可接受性中一個重要的感官方面，直接影響消費(fèi)者的購買力[2]。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)作為風(fēng)味的關(guān)鍵指標(biāo)之一，對臘肉產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量控制有著重要的意義。將人工培養(yǎng)微生物應(yīng)用到發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過程中可以減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生和積累，并且能產(chǎn)生促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪分解的酶類，為產(chǎn)品風(fēng)味的形成做出貢獻(xiàn)[3]。

近年來，國內(nèi)外針對功能微生物應(yīng)用于發(fā)酵肉制品已進(jìn)行了大量研究[4-7]，主要集中在探究功能微生物對肉制品安全性、抗氧化性和風(fēng)味特性影響等方面。Zhang Qilin等[8]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZY-40可有效控制發(fā)酵鰱魚香腸中的生物胺，提高產(chǎn)品的安全性。何健葉[9]使用乳桿菌和模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans）進(jìn)行香腸發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，各項指標(biāo)均優(yōu)于不添加發(fā)酵劑的對照組，產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和色澤明顯得到改善，且產(chǎn)品的貨架期延長。馮美琴等[10]以植物乳桿菌CD101和模仿葡萄球菌NJ201作為混合發(fā)酵劑制作發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)接種該混合發(fā)酵劑制作發(fā)酵香腸能促進(jìn)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生更多具有抗氧化活性的多肽，從而有助于通過內(nèi)源性抗氧化肽抑制發(fā)酵香腸的氧化。Chen Qian等[11]從哈爾濱干香腸中分離出4 株乳酸菌，探究其對豬肉肌漿蛋白提取物中蛋白質(zhì)水解和風(fēng)味形成的影響，發(fā)現(xiàn)4 株菌能利用肌漿蛋白產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，能產(chǎn)生可溶性肽和呈味游離氨基酸。

已經(jīng)開發(fā)的肉用商業(yè)發(fā)酵劑有植物乳桿菌、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（S. xylosus）、肉葡萄球菌（S. carnosus）、清酒乳桿菌（L. sakei）和漢遜德巴利酵母菌（Debaromyces hansenii）等[12-13]。它們都是通過產(chǎn)酸或者細(xì)菌素等提高肉制品的安全性，豐富肉制品的功能特性和風(fēng)味特性[3]。目前的研究大多都采用單一菌株或者多種菌株直接復(fù)合的方式進(jìn)行肉品接種發(fā)酵，而鮮有見將兩種或多種微生物分階段接種發(fā)酵的報道。

為此，本研究選用分離自傳統(tǒng)隴西臘肉的產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的3 株優(yōu)勢細(xì)菌（木糖葡萄球菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides））為發(fā)酵劑，依據(jù)傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中微生物群落演替規(guī)律[14]，以木糖葡萄球菌為前發(fā)酵劑，植物乳桿菌和腸膜明串珠菌復(fù)合為后發(fā)酵劑，模擬臘肉發(fā)酵工藝，分階段接種于肉品中，探究二次接種時間對臘肉揮發(fā)性風(fēng)味特性的影響，旨在為臘肉現(xiàn)代化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌種

五花肉購自北京華聯(lián)超市。

木糖葡萄球菌MT、植物乳桿菌ZR、腸膜明串珠菌CM均分離自傳統(tǒng)隴西臘肉。對菌株的產(chǎn)酸性、產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶能力，以及耐鹽性等進(jìn)行了驗證[15]，發(fā)現(xiàn)這些菌株在傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中具備潛在的發(fā)酵優(yōu)勢。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

2-辛醇（色譜純）、正構(gòu)烷烴（C8～C25） 美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉（分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉浸粉8.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.04 g、瓊脂14.0 g、吐溫80 1.0 mL、蒸餾水1 L，pH 6.5±0.2。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1 L，pH 7.3±0.1。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；Ax10 Axio生物顯微鏡 德國蔡司公司；固相微萃取裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭 美國Surpelco公司；TRACE1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 法國Salleron公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶驗證[16-17]

產(chǎn)蛋白酶驗證培養(yǎng)基在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入1%的脫脂奶粉，37 ℃培養(yǎng)24 h，在菌落周圍能產(chǎn)生潔凈圈的即為高產(chǎn)蛋白酶的菌株。產(chǎn)脂肪酶驗證培養(yǎng)基在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入1%的乳化橄欖油和0.1%羅丹明B，37 ℃培養(yǎng)48 h，在紫外線下拍照觀察，能在培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的熒光圈，即被認(rèn)為是高產(chǎn)脂肪酶的菌株。

1.3.2 發(fā)酵劑的復(fù)配及接種方案

李彥虎[14]對傳統(tǒng)隴西臘肉制作過程中微生物群落演替規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬在隴西臘肉制作的發(fā)酵前期豐度最高，乳酸菌屬在發(fā)酵后期豐度最高。因此，本實驗選用木糖葡萄球菌作為前發(fā)酵劑（記為F-0），在第0天時添加；植物乳桿菌和腸膜明串珠菌（1∶1）復(fù)合作為后發(fā)酵劑，第1組（F-6）在發(fā)酵過程中的第6天時添加，第2組（F-10）在發(fā)酵過程中的第10天時添加，第3組（F-14）在發(fā)酵過程中的第14天時添加，并以不接種發(fā)酵劑的自然發(fā)酵組為對照（CK）。

1.3.3 發(fā)酵劑的活化與制備

木糖葡萄球菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，植物乳桿菌和腸膜明串珠菌在MRS培養(yǎng)基上48 h，分別活化3 次后，接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h，血球計數(shù)板計數(shù)，達(dá)到108CFU/mL以上即可，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌3 次后重懸，菌懸液保留備用。

1.3.4 臘肉的制作

工藝流程：原料肉的選擇→清洗殺菌→低溫腌制→接種發(fā)酵→發(fā)酵成熟。

選擇新鮮五花肉，切成長12～15 cm、寬5～7 cm的肉條，清洗干凈，用紫外照射殺菌30 min，置于4 ℃冰箱備用。然后抹上食鹽（用量為3%），在4 ℃冰柜腌制48 h。腌制完成后，將活化好的發(fā)酵劑菌懸液接種于腌制好的肉中（肉塊按2 cm3等分，分別在每個等分方塊中用注射器注射接種活化后的發(fā)酵劑種子液1 mL，肉塊兩端穿繩吊掛于框內(nèi)，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（（15±1）℃、相對濕度80%），發(fā)酵20 d。除食鹽外，本實驗不添加任何香辛料。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.3.5.1 萃取條件

參照師希雄等[18]方法并作修改。準(zhǔn)確稱取5 g臘肉樣品、2 g氯化鈉于20 mL頂空瓶中壓蓋，溫度70 ℃于水浴鍋加熱平衡10 min，然后將頂空萃取頭插入玻璃瓶內(nèi)。萃取時間為30 min，萃取完成后，于GC-MS進(jìn)樣口250 ℃解吸5 min。

1.3.5.2 GC條件

DB-WAX毛細(xì)管柱（60 m×250 μm，0.25 μm），起始溫度40 ℃，保持1 min，以4 ℃/min的速率上升至220 ℃保持15 min；載氣（He）流速1.0 mL/min。不分流進(jìn)樣。

1.3.5.3 MS條件

電子電離源：70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度180 ℃，掃描質(zhì)量范圍m/z50～350。

1.3.5.4 定性與定量

取正構(gòu)烷烴混標(biāo)（C8～C25）按照上述實驗條件進(jìn)行GC-MS分析，記錄每個正構(gòu)烷烴的保留時間，對質(zhì)譜全離子掃描圖譜所得的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行保留指數(shù)的計算，如式（1）所示。結(jié)合NIST質(zhì)譜庫按照正反匹配度大于700對所測得的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

式中：n和n+1分別為目標(biāo)物出峰前后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tn和tn+1分別為相應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時間；tx為未知物在氣相色譜中的保留時間（tn＜tx＜tn+1）。

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)是質(zhì)量濃度為81.06 μg/mL二辛醇，揮發(fā)性物質(zhì)含量按式（2）計算：

1.3.6 特征揮發(fā)性物質(zhì)的評價

參照劉登勇等[19]的方法。樣品中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析法確定。在此之前，需要先確定對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性組分。鑒于此，本研究采用氣味活度值（odor activity value，OAV）方法，即嗅感物質(zhì)的絕對濃度與其感覺閾值之間的比值。規(guī)定對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性組分ROAVmax為100，其他揮發(fā)性組分ROAV按式（3）計算。對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大，揮發(fā)性組分的ROAV一般越大。

式中：Ci和Cmax分別為各揮發(fā)性組分和對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性組分的相對含量/%；Ti和Tmax為各揮發(fā)組分和對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性組分的感覺閾值/（μg/L）。

1.3.7 感官評價

參照孔曉雪等[20]方法并修改。選擇10 位無飲食偏好的人員且經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練，以此組成感官評價小組，分別將各樣品置于蒸鍋中蒸制（樣品中心溫度達(dá)到65～70 ℃后，維持30 min），切成厚度為0.5 cm的切片，分別以肉色、口感、氣味、滋味、組織狀態(tài)5 項指標(biāo)對臘肉樣品進(jìn)行評定（評定室溫度（20±2）℃，相對濕度60%～75%，白色燈光，配有換氣裝置），以此確定制作過程中感官品質(zhì)的變化。評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented dry-cured meat

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，使用IBM SPSS Statistics 20.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，利用Origin 2018進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），Heml 1.0.3.7軟件進(jìn)行熱圖分析，所得實驗數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶驗證實驗

圖1結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24～48 h后3 株菌均出現(xiàn)透明圈（圖1A）和熒光圈（圖1B），證明3 株菌均能產(chǎn)生蛋白水解酶和脂肪酶，具備潛在的肉類發(fā)酵能力。

圖1 產(chǎn)蛋白酶（A）和產(chǎn)脂肪酶（B）驗證結(jié)果Fig. 1 Identification of protease-producing ability (A) and lipase-producing ability (B)

2.2 不同處理組臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的變化

利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）方法，從4個處理組（CK、F-6、F-10、F-14）中共鑒定出72 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醛類15 種、酯類19種、醇類13種、酸類13種和其他類12 種。其中，CK組共檢出醛類9種、酯類9種、醇類6 種、酸類6 種、其他類8 種；F-6組共檢出醛類10 種、酯類16 種、醇類7 種、酸類8 種、其他類10 種；F-10組共檢出醛類13種、酯類15 種、醇類10 種、酸類10 種、其他類9種；F-14組共檢出醛類12 種、酯類11 種、醇類5 種、酸類6 種、其他類9種。如圖2A所示，3 組處理組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類均顯著多于CK組（P＜0.05），其中，處理組F-10的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最多，表明復(fù)合發(fā)酵劑在一定程度上能顯著提高臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類，且在發(fā)酵中期二次接種發(fā)酵時，能使揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類更豐富。由圖2B所示，不同處理組的離子強(qiáng)度（峰高）在同一保留時間上不同，表明同一種揮發(fā)性物質(zhì)在不同處理組中的含量不同；在同一處理組中，不同保留時間的離子強(qiáng)度（峰高）不同，表明不同的揮發(fā)性物質(zhì)在同一處理上的含量也不同。

圖2 不同處理組臘肉揮發(fā)性物質(zhì)的種類（A）和總離子流圖（B）Fig. 2 Composition (A) and total ion current chromatogram (B) of volatile compounds in naturally fermented and inoculated meat

2.2.1 醛類物質(zhì)

醛類物質(zhì)是由不飽和脂肪酸的氧化和氨基酸Strecker反應(yīng)產(chǎn)生，能夠反映脂肪氧化的程度[21]。醛類物質(zhì)因具有很強(qiáng)的揮發(fā)性且閾值較低，對臘肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大[22]，但較高含量也會對臘肉風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響[23]。由表2所示，共檢出15 種醛類物質(zhì)，不同處理組之間種類差異明顯，其中F-10組檢出13種醛類化合物，顯著多于其他組（P＜0.05），這表明，在發(fā)酵中期進(jìn)行二次接種，能更有效地增強(qiáng)臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類，使風(fēng)味更加豐富。醛類香氣物質(zhì)的含量在不同處理之間差異也很明顯，其中CK組的醛類物質(zhì)的總含量最高，為1 746.46 μg/kg，顯著高于各二次接種組（P＜0.05），表明接種發(fā)酵劑具有一定的抗氧化能力，抑制了脂肪的氧化程度，這一結(jié)果與曹辰辰等[24]探究功能性發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸氧化穩(wěn)定性及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響的結(jié)果一致。

表2 不同處理組臘肉的醛類物質(zhì)Table 2 Contents and aroma descriptions of aldehydes in naturally fermented and inoculated meat

2.2.2 酯類物質(zhì)

研究表明，酯類物質(zhì)對臘肉風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)是水果味[25]，如丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯等都呈現(xiàn)水果香味，而這些物質(zhì)主要是其對應(yīng)的酸與醇類在微生物的作用下發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生[26-27]。由表3可知，不同處理組臘肉的酯類物質(zhì)在種類和含量上差異都很明顯（P＜0.05），且添加發(fā)酵劑組均顯著高于CK組。本研究中，酯類物質(zhì)含量最高的是己酸乙酯和辛酸乙酯，己酸乙酯具有強(qiáng)烈的酒香且有很強(qiáng)的持久力，而辛酸乙酯具有白蘭地酒香味[22]，對臘肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，這兩種酯類物質(zhì)的含量在發(fā)酵中期（F-10）時顯著高于其他組，說明在發(fā)酵中期進(jìn)行二次接種更有利于豐富臘肉的風(fēng)味。

表3 不同處理組臘肉的酯類物質(zhì)Table 3 Contents and aroma descriptions of esters in naturally fermented and inoculated meat

2.2.3 醇類物質(zhì)

如表4所示，本實驗共檢出13種醇類物質(zhì)。研究證明[28]，醇類物質(zhì)因其含量低，且閾值較高，所以對臘肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)并不大，但也有部分醇類物質(zhì)因閾值較低，已被證實對發(fā)酵肉制品的整體風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)，如Maru?i?等[29]研究發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇在火腿中含量較高，其呈現(xiàn)蘑菇味，是火腿中的重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。同樣，在本實驗中臘肉的醇類物質(zhì)含量最高的也是1-辛烯-3-醇，該物質(zhì)閾值較低，對臘肉的整體風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)作用。李彥虎[14]探究傳統(tǒng)隴西臘肉群落演替規(guī)律對風(fēng)味變化的影響時發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇與葡萄球菌具有較強(qiáng)的相關(guān)性，本實驗檢出的1-辛烯-3-醇含量在3個復(fù)合發(fā)酵組中顯著高于CK組（P＜0.05），證明所添加的木糖葡萄球菌對臘肉風(fēng)味形成發(fā)揮了一定的作用，并且3個復(fù)合發(fā)酵組臘肉中檢出了具有香醋味的正戊醇，在CK組中并未檢出，推測這可能是添加的發(fā)酵劑導(dǎo)致產(chǎn)生。在不同的復(fù)合發(fā)酵組中，F(xiàn)-10組臘肉的醇類物質(zhì)在種類和含量上均顯著高于其他組（P＜0.05），說明在發(fā)酵中期進(jìn)行二次接種更有利于臘肉風(fēng)味的形成。

表4 不同處理組臘肉的醇類物質(zhì)Table 4 Contents and aroma descriptions of alcohols in naturally fermented and inoculated meat

2.2.4 酸類物質(zhì)

酸類物質(zhì)主要來源于脂肪降解和氧化[30]。如表5所示，本實驗共檢出13種酸類物質(zhì)，主要為丁酸、正己酸、正癸酸和辛酸等。而這些化合物都有特殊的風(fēng)味，如丁酸具有腐臭的酸味，正己酸具有不愉快的辛辣味，正癸酸具有不愉快的氣味，辛酸具有腐臭味等[23]。這些可能是臘肉異味的主要貢獻(xiàn)者。本研究中，CK組臘肉的酸類化合物含量整體高于3個復(fù)合發(fā)酵組，且差異顯著（P＜0.05），表明添加復(fù)合發(fā)酵劑能有效控制臘肉異味的產(chǎn)生。比較3個復(fù)合發(fā)酵組臘肉的酸類物質(zhì)，能夠看出F-10組臘肉的酸類物質(zhì)含量最低，證明在發(fā)酵中期進(jìn)行二次接種能更有效降低臘肉不良風(fēng)味的形成。

表5 不同處理組臘肉的酸類物質(zhì)Table 5 Contents and aroma descriptions of organic acids in naturally fermented and inoculated meat

2.2.5 酮、酚和其他類物質(zhì)

如表6所示，本研究共檢出4 種酮類物質(zhì)，主要是呈現(xiàn)蘑菇味的1-辛烯-3-酮和具有奶油香的2,3-辛二酮。其中2,3-辛二酮只在3個復(fù)合發(fā)酵組臘肉中均有檢出，CK組臘肉中并未檢出，而1-辛烯-3-酮的含量卻在CK組臘肉中最高，可能是所添加的發(fā)酵劑使其轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物導(dǎo)致其含量降低。研究者認(rèn)為，酮類物質(zhì)主要來自于多不飽和脂肪酸的氧化，其作為中間產(chǎn)物也會轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物[31]，這可能也是造成本研究結(jié)果的主要原因。酚類是腌臘肉制品的典型風(fēng)味成分，且閾值較低，對臘肉風(fēng)味的形成及抗氧化有重要貢獻(xiàn)[32]。本實驗共檢出3種酚類物質(zhì)，其中，苯酚賦予臘肉酚香味，對甲酚賦予臘肉芳香味。在各處理組中，F(xiàn)-10組臘肉的酚類物質(zhì)含量顯著高于其他組（P＜0.05），達(dá)到91.20 μg/kg。本實驗共檢出5 種其他類物質(zhì)，這些物質(zhì)應(yīng)閾值較高，且含量較低，對臘肉風(fēng)味的形成影響不大，因此對臘肉香氣的貢獻(xiàn)可以忽略。但值得注意的是，具有青香、肉香味的2-戊基呋喃被認(rèn)為是對臘肉風(fēng)味具有貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)[22]，而本實驗只在CK組中檢出了2-戊基呋喃，3個復(fù)合發(fā)酵組中并未檢出，推測可能是微生物的作用使其前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物所致。

表6 不同處理組臘肉的酮、酚及其他類物質(zhì)Table 6 Contents and aroma descriptions of ketones, phenols and other substances in naturally fermented and inoculated meat

2.2.6 熱圖分析

為進(jìn)一步探討不同二次接種時間下臘肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的特點(diǎn)，將表2～6的所有物質(zhì)進(jìn)行了熱圖分析（圖3）。不同處理間各揮發(fā)性香氣成分的含量差異顯著，根據(jù)不同處理間的聚類分析可知，F(xiàn)-6和F-10兩組處理聚在一起，說明在發(fā)酵前期和發(fā)酵中期進(jìn)行二次接種所形成的香氣成分比較接近，而后再跟F-14聚在一起，最后和CK組發(fā)生聚類，說明添加的復(fù)合發(fā)酵劑能有效改善臘肉的整體風(fēng)味，對臘肉風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)作用。

圖3 不同處理組臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的熱圖Fig. 3 Heat map of the volatile flavor contents in naturally fermented and inoculated meat

2.3 不同處理組臘肉ROAV和PCA

2.3.1 ROAV分析

臘肉的揮發(fā)性化合物中，對香氣起主要貢獻(xiàn)作用的通常僅是一小部分化合物，而且這些成分對香氣的貢獻(xiàn)取決于其濃度與閾值，單方面通過含量評價揮發(fā)性風(fēng)味化合物對臘肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)不全面。為進(jìn)一步探究不同二次接種時間對臘肉風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的主體揮發(fā)性化合物的影響，基于OAV法和ROAV法并結(jié)合揮發(fā)性物質(zhì)感覺閾值對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了篩選。如表7所示，ROAV在1～100之間的物質(zhì)為CK組13種、F-6組14 種、F-10組20 種、F-14組18 種，ROAV在0.1～1之間的物質(zhì)為CK組5 種、F-6組3種、F-10組4 種、F-14組4 種，遠(yuǎn)小于由質(zhì)譜和保留指數(shù)法所確定的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類，說明大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)都沒有氣味特征，或其閾值較高，對臘肉的整體風(fēng)味沒有顯著貢獻(xiàn)。分析不同處理之間的ROAV發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合發(fā)酵劑的3 組ROAV大于1的物質(zhì)種類明顯多于CK組，這與由質(zhì)譜和保留指數(shù)法所得結(jié)果一致，證明添加發(fā)酵劑能顯著改善臘肉的整體風(fēng)味特性。分析3 組添加發(fā)酵劑的臘肉ROAV發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-10組ROAV大于1的物質(zhì)種類明顯高于F-6組和F-14組，說明在發(fā)酵中期進(jìn)行二次接種能更有效地豐富臘肉風(fēng)味化合物。

表7 不同處理組臘肉關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)Table 7 Key flavor compounds in naturally fermented and inoculated meat

2.3.2 PCA

PCA方法主要研究ROAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如表8所示，PC1、PC2、PC3方差貢獻(xiàn)率分別是70.43%、18.43%和6.93%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)95.79%，說明能夠完全代表樣品的主要信息特征。由圖4A可知，F(xiàn)-6和F-10兩組聚在同一象限，CK和F-14兩組聚在同一象限，表明產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)相似，這一結(jié)果與熱圖聚類分析（圖3）的結(jié)果一致。由圖4B可知，F(xiàn)-10組獨(dú)居一象限，與其他3 組明顯分開，說明該組臘肉的風(fēng)味成分與其他組差異顯著，而該組的主要代表物質(zhì)是A4（壬醛）、A8（(E,E)-2,4-癸二烯醛）、B2（己酸乙酯）和C2（1-辛烯-3-醇）。結(jié)合PC，可以良好區(qū)分不同二次接種時間下樣品，為后期復(fù)合發(fā)酵劑的添加提供理論依據(jù)。

表8 PC特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 8 Eigenvalues of principal components and their contribution rates to total variance

圖4 不同處理組臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA載荷圖Fig. 4 PCA loading plots of volatile flavor compounds in naturally fermented and inoculated meat

2.4 感官評價

如圖5所示，對不同二次接種時間下的臘肉從肉色、組織形態(tài)、滋味、口感和氣味5個方面進(jìn)行感官分析，結(jié)果顯示，3 組添加復(fù)合發(fā)酵劑的臘肉評分整體高于CK組，尤其是在氣味方面，表現(xiàn)出明顯的臘香味，而CK組的臘香味較淡，且有輕微的霉味，感官結(jié)果與揮發(fā)性風(fēng)味成分結(jié)果基本一致，說明所添加的發(fā)酵劑能夠改善臘肉的整體風(fēng)味。

圖5 不同處理組臘肉的感官雷達(dá)圖Fig. 5 Sensory evaluation radar chart of naturally fermented and inoculated meat

3 結(jié) 論

本實驗采用SPME-GC-MS技術(shù)，結(jié)合ROAV評價方法對不同二次接種時間發(fā)酵臘肉的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的差異進(jìn)行檢測分析，共檢測出醛類、酯類、醇類、酸類、酮類、酚類、烯烴類等72 種揮發(fā)性化合物。其中，CK組臘肉共檢出38 種，F(xiàn)-6組臘肉中檢出51 種，F(xiàn)-10組臘肉中檢出57 種，F(xiàn)-14組臘肉中檢出43種，總量分別是6 031.07、6 556.89、6 528.27、6 053.56 μg/kg，添加復(fù)合發(fā)酵劑的臘肉的揮發(fā)性化合物在種類和含量上均高于CK組。綜合PCA和熱圖分析結(jié)果，F(xiàn)-6組和F-10組臘肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分較相似，而F-10組臘肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分更豐富。ROAV結(jié)果分析顯示，壬醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、己酸乙酯、辛酸乙酯和1-辛烯-3-醇是復(fù)合發(fā)酵組的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，且F-10組臘肉的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)種類最多。感官結(jié)果顯示，F(xiàn)-10組臘肉的臘香味更加明顯，且感官評分最高。綜合以上結(jié)論，接種復(fù)合發(fā)酵劑能顯著增加臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，且在發(fā)酵中期（F-10）進(jìn)行二次接種更有利于臘肉風(fēng)味的形成，可為人工接種發(fā)酵臘肉提供理論依據(jù)。