楊 博，柏 吉，靳亞梅，王 歡，倪永清,*，李 谞,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新農(nóng)乳業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 阿拉爾 843300）

凡是能利用葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌[1]。乳酸菌能提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，增加食品的保藏性和附加值，是天然的防腐劑[2]，被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和蔬菜制品等。

發(fā)酵乳制品是原料乳在特定微生物的作用下通過發(fā)酵制成的酸性乳制品，其中乳酸菌發(fā)酵劑的發(fā)酵性能（產(chǎn)酸、產(chǎn)黏、產(chǎn)香和后酸化等）[3]及益生特性（抑菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等）直接影響最終發(fā)酵乳制品的質(zhì)量及風(fēng)味好壞[4]。目前，發(fā)達(dá)國家對發(fā)酵劑的研究及產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)高度成熟[5]。我國具有得天獨(dú)厚的微生物資源優(yōu)勢，開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑，使發(fā)酵劑的制備逐步形成專業(yè)化和規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)體系，突破發(fā)達(dá)國家的行業(yè)壟斷已是當(dāng)務(wù)之急。

我國新疆地區(qū)的畜牧業(yè)發(fā)達(dá)，乳源豐富，該地區(qū)少數(shù)民族自古就有手工加工和食用發(fā)酵乳制品的傳統(tǒng)，特色發(fā)酵乳制品大多為自然環(huán)境中使用動(dòng)物原乳發(fā)酵而成[6]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物原乳（驢乳、駱駝乳等）和發(fā)酵乳制品中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源[7-9]，是開發(fā)野生型優(yōu)良乳酸菌及潛在益生菌的天然寶庫。雖然發(fā)達(dá)國家有開發(fā)成熟的發(fā)酵劑，但由于技術(shù)壟斷很難惠及不發(fā)達(dá)國家，尤其是經(jīng)濟(jì)落后的地區(qū)；同時(shí)，從消費(fèi)群體的地域性以及腸道微生態(tài)理論出發(fā)，從本地食品更容易篩選到適應(yīng)當(dāng)?shù)仫嬍沉?xí)慣人群的益生性發(fā)酵劑[10]，開發(fā)這些乳酸菌資源將有助于本地企業(yè)研發(fā)具有明顯地域特色的功能性食品。

目前，新疆地區(qū)驢產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，驢乳逐漸成為研究和開發(fā)利用的熱點(diǎn)[11]。有研究認(rèn)為，驢乳的營養(yǎng)價(jià)值與人乳相近，尤其是對一些疾病的治療和抗菌活性效果明顯，其營養(yǎng)價(jià)值、活性組分和免疫調(diào)節(jié)作用成為研究熱點(diǎn)[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，原乳中蘊(yùn)含了豐富的乳酸菌資源，但目前國內(nèi)外報(bào)道的大部分乳酸菌發(fā)酵劑來自發(fā)酵乳品，針對動(dòng)物原乳篩選的發(fā)酵劑報(bào)道較少[15]，尤其與其他動(dòng)物乳相比，關(guān)于驢乳源乳酸菌資源的報(bào)道更少。本研究從新疆哈密地區(qū)采集的驢乳中分離野生乳酸菌菌株，篩選優(yōu)良的乳酸菌發(fā)酵劑，并測試菌株的益生特性，以期為開發(fā)我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌發(fā)酵劑，以及為研發(fā)具有地域特色的功能性發(fā)酵乳品、推動(dòng)當(dāng)?shù)厝槠沸袠I(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

15個(gè)驢乳樣品來源于新疆哈密地區(qū)巴里坤縣的健康母驢。驢的品種均為新疆驢，喂養(yǎng)方式是家庭散養(yǎng)型，飼料主要為苜蓿、青干草和秸稈混合，日產(chǎn)乳約1～2 kg，用處主要是農(nóng)作、拖貨等。驢乳收集時(shí)，并無自動(dòng)的擠乳設(shè)備，由牧民佩戴一次性無菌手套，用75%乙醇溶液浸泡的紗布擦拭母驢乳頭及周圍，并丟棄第1批乳，收集5 mL的驢乳于無菌離心管中，密封和記錄后放入-20 ℃的車載冰箱，在24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 指示菌

致病性大腸埃希氏菌（CICC 10411）、腸毒素性大腸埃希氏菌（CICC 10421）、出血性大腸埃希氏菌（CICC 21530）、鼠傷寒沙門氏菌（CICC 10420）、單核細(xì)胞性李斯特菌（CGMCC 1.9136）、血清型腸炎沙門氏菌（CGMCC 1.10754）、金黃色葡萄球菌（CICC 21600）和標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠李糖乳桿菌GG均購自于中國工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基（MRS肉湯添加1.7%的瓊脂）、M17肉湯培養(yǎng)基及M17固體培養(yǎng)基（M17肉湯添加1.7%的瓊脂）參照文獻(xiàn)[16]配制；LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、蛋白胨酵母葡萄糖（peptone yeast glucose，PYG）培養(yǎng)基、胰蛋白大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司。

鄰苯三酚、濃鹽酸、硫酸亞鐵（均為分析純）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；脫脂乳粉 內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG520厭氧培養(yǎng)箱 英國DWS公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng) 法國Vilber公司；相差顯微鏡上海光密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 驢乳樣品中乳酸菌的分離純化

先將MRS、M17培養(yǎng)基配好滅菌后倒平板，待其凝固，將采集的驢乳樣品使用無菌生理鹽水稀釋，在稀釋梯度為10-3、10-4、10-5的情況下分別吸取100 μL稀釋液于平板上進(jìn)行涂布，將涂布后的平板放入37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h[8]。每個(gè)平板挑取顏色、大小和形狀均不同的單菌落進(jìn)行鏡檢，保留細(xì)胞形態(tài)呈桿狀或球狀的菌落，連續(xù)轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3 次后，挑取純的單菌落于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)，從而實(shí)現(xiàn)疑似乳酸菌的初步篩選、分離及純化。將疑似乳酸菌活化、富集后，以2%接種量接種到12%滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng)，選擇使脫脂乳凝乳完全，表面無乳清析出的菌株保藏至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 16S rRNA基因序列分析

將具備凝乳特性的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定其種屬。DNA的提取采用改良后的苯酚-氯仿-玻璃珠法[12]。利用27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）PCR通用引物對菌株進(jìn)行基因擴(kuò)增[16]。擴(kuò)增條件為：35個(gè)循環(huán)（95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min），72 ℃終延伸10 min。吸取3 μL的PCR產(chǎn)物于1.5 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將余下PCR產(chǎn)物送至上海美吉公司測序。將所測的16S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST進(jìn)行序列同源性分析，采用MEGA v.7.0軟件建立發(fā)育樹。

1.3.3 優(yōu)良發(fā)酵劑篩選

1.3.3.1 凝乳時(shí)間確定、酸度測定及感官評價(jià)

菌株活化后，再經(jīng)生理鹽水洗滌和重懸，按2%接種量轉(zhuǎn)接至脫脂乳中，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，凝乳后記錄凝乳時(shí)間并將其放入4 ℃冰箱冷藏，取冷藏24 h后的樣品進(jìn)行酸度測定和感官評價(jià)，其中酸度測定方法參考文獻(xiàn)[7]。

組織經(jīng)過培訓(xùn)的10 名食品專業(yè)的學(xué)生對樣品的氣味、外觀、質(zhì)地、口感和喜愛程度5個(gè)感官指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，每個(gè)指標(biāo)均為20 分，具體評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[17]。

1.3.3.2 菌株產(chǎn)酸能力的測定

將乳酸菌活化后，再經(jīng)洗滌和重懸后，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至脫脂乳中，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)。每隔2 h取樣，測定可滴定酸，連續(xù)測定24 h，并作酸度隨時(shí)間變化的產(chǎn)酸曲線，酸度測定參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3.3 菌株后酸化能力的測定

將達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的樣品在4 ℃冷藏，分別于第1、4、8、12、16、20天取樣測定滴定酸度。酸度測定參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3.4 菌株產(chǎn)香能力的測定

參考蘇媛寧等[18]的方法，測定后熟1 d后發(fā)酵乳的雙乙酰和乙醛含量。

1.3.3.5 發(fā)酵乳中活菌數(shù)的測定

樣品在4 ℃冷藏，分別于第1、4、8、12、16、20天取樣稀釋涂布，利用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.3.4 菌株益生特性分析

1.3.4.1 模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)

模擬胃液的配制：125 mmol/L NaCl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3和3 g/L胃蛋白酶，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 2.5；模擬腸液的配制：45 mmol/L NaCl、1 g/L胰蛋白酶、3 g/L牛膽鹽，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 8.0，所配溶液均過0.22 μm濾膜除菌[19]。

菌株活化后，以1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，3 000×g離心10 min后收集菌體，反復(fù)洗滌后重懸，再以1%的接種量接種于模擬胃液中，混勻，37 ℃培養(yǎng)，分別在0、90、180 min取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；另吸取1 mL重懸液接種到9 mL模擬腸液中，37 ℃培養(yǎng)，分別在第120分鐘和第240分鐘取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。陰性對照為液體MRS培養(yǎng)基，陽性對照為鼠李糖乳桿菌GG。3 次平行，統(tǒng)計(jì)結(jié)果[20]。

1.3.4.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

無細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free fermentation supernatant，CFCS）的制備：菌株活化后，以1%接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，7 500×g離心10 min獲得上清液，過0.45 μm濾膜除菌，pH值調(diào)節(jié)至6.5，4 ℃保存?zhèn)溆谩４送?，為確定CFCS中抑菌物質(zhì)是否含有類細(xì)菌素物質(zhì)，向CFCS中加入1 mg/mL蛋白酶K，37 ℃水浴2 h后，4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

抑菌實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法[22]。將致病性大腸桿菌（EC1）、腸毒素性大腸桿菌（EC2）、出血性大腸桿菌（EC3）和金黃色葡萄球菌（SA）接種于液體LB培養(yǎng)基中；將血清型腸炎沙門氏菌（SM1）和鼠傷寒沙門氏菌（SM2）接種于液體TSA培養(yǎng)基中；將李斯特菌（LS1）接種于液體PYG培養(yǎng)基中。以上致病菌均在37 ℃培養(yǎng)18 h，各取0.1 mL培養(yǎng)液稀釋，得到濃度約為105～106CFU/mL的稀釋液。分別取0.1 mL菌懸液均勻涂布在對應(yīng)的培養(yǎng)基表面，于其表面上等距離放入4個(gè)牛津杯，其中3個(gè)加入0.2 mL CFCS或經(jīng)蛋白酶處理的CFCS，余下1個(gè)加入無菌的MRS培養(yǎng)基（空白對照），4 ℃預(yù)擴(kuò)散6～8 h后，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，每組3個(gè)平行，求其均值。

1.3.4.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)WHO推薦使用的方法[23]，采用K-B紙片擴(kuò)散法對菌株進(jìn)行20 種常用抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)。將菌懸液稀釋至107～108CFU/mL，取0.12 mL于MRS固體培養(yǎng)基表面后，涂布均勻，待表面干燥后將抗生素藥片貼于其表面，每個(gè)培養(yǎng)基均分貼4個(gè)藥片，貼好后37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑，每種藥片3個(gè)平行。

1.3.4.4 抗氧化活性測定

參考Shi Yunjia等[24]方法，略作修改，對菌株進(jìn)行羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)。制備抗氧化活性測定樣品[24]：菌株接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，9 000×g離心5 min，棄上清液，菌體用無菌水洗滌2 次，再重懸于無菌水中至菌濃度為109CFU/mL。

羥自由基清除實(shí)驗(yàn)：將1 mL 0.75 mmol/L 1,10-鄰菲咯啉溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1.5 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液混合均勻后，立即加入1 mL CFCS，搖勻后37 ℃反應(yīng)30 min，測定536 nm波長處吸光度，3 次平行。羥自由基清除率按式（1）計(jì)算：

式中：A1為樣品與自由基反應(yīng)后的溶液吸光度；A0為水代替樣品反應(yīng)后的溶液吸光度；A2為水代替自由基反應(yīng)后的溶液吸光度。

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)：將1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液和0.8 mL CFCS混合均勻，黑暗下反應(yīng)30 min，測定517 nm波長處吸光度，3 次平行。DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算：

式中：A1為樣品與自由基反應(yīng)后的溶液吸光度；A0為水代替樣品反應(yīng)后的溶液吸光度。

超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)：將0.2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液和0.8 mL CFCS混合均勻，測定320 nm波長處吸光度；再向混合液中加入0.1 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后再次測定320 nm波長處吸光度。超氧陰離子自由基清除率按式（3）計(jì)算：

式中：A11為加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A12為未加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A0為水代替樣品的溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以表示，顯著性分析使用Duncan檢驗(yàn)（P＜0.05，差異顯著）；使用Origin 9.0軟件繪圖，熱圖繪制采用Heml 1.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似乳酸菌菌株的分離

從15個(gè)驢乳樣品中共分離出56 株純培養(yǎng)物，通過肉眼觀察菌落大小、顏色，鏡檢菌落形態(tài)為桿狀或球狀，以及革蘭氏陽性和接觸酶陰性確定38 株疑似乳酸菌，其中具有明顯凝乳特性的菌株7 株。

2.2 16S rRNA基因序列分析結(jié)果

將7 株菌的16S rRNA部分基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，選取相似性高的菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1?？芍?，HL12-21、HL29-5、HL30-3、HL21-44、HL26-24、HL29-1和HL13-23分別與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）的親緣關(guān)系最近，且序列相似性均高達(dá)100%。

圖1 基于16S rRNA基因序列的乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequence

2.3 優(yōu)良發(fā)酵劑篩選

2.3.1 凝乳時(shí)間、酸度及感官評價(jià)結(jié)果

凝乳時(shí)間的長短不僅體現(xiàn)了菌株的生長以及產(chǎn)酸特性，時(shí)間太短，則不利于酸乳香味的形成，若時(shí)間太長，影響生產(chǎn)成本[25]。由表1可知，7 株菌株的凝乳時(shí)間在13 h內(nèi)，但發(fā)酵劑由多種菌制備，可以彌補(bǔ)部分菌株凝乳時(shí)間過長的缺陷，所以它們的凝乳時(shí)間均在可接受范圍。

表1 7 株菌制備酸乳凝乳時(shí)間、酸度及感官評價(jià)結(jié)果Table 1 Milk coagulation times, acidities and sensory evaluation scores of milks fermented with seven selected strains

7 株菌制備酸乳4 ℃冷藏24 h后酸度在58～85 °T之間（表1），GB 19302—2010《發(fā)酵乳》[26]規(guī)定酸乳酸度應(yīng)大于70 °T，雖然菌株HL26-24和HL13-23制備的酸乳酸度低于70 °T，但考慮到后期是復(fù)合發(fā)酵劑制備酸乳，因此可以彌補(bǔ)2 株菌產(chǎn)酸不足的缺陷。

感官評價(jià)是評價(jià)酸乳質(zhì)量、口感和風(fēng)味等重要指標(biāo)[27]，對菌株能否用于酸乳的生產(chǎn)至關(guān)重要。如表1所示，由菌株HL12-21、HL21-44、HL29-1和HL29-5分別制備的酸乳均色澤良好，呈乳白色，具有酸乳特有的風(fēng)味，無氣泡，無乳清析出，質(zhì)地細(xì)膩且表面光滑，它們的綜合評分最高；菌株HL30-3制備的酸乳色澤呈微黃色，具有酸乳特有的風(fēng)味，雖表面有輕微的乳清析出，但質(zhì)地細(xì)膩和無氣泡；菌株HL13-23和HL26-24制備的酸乳色澤呈乳白色，具有酸乳特有的風(fēng)味但有少許澀味。

2.3.2 產(chǎn)酸能力測定結(jié)果

菌株產(chǎn)酸能力是評價(jià)發(fā)酵劑的一項(xiàng)重要指標(biāo)，不同菌株產(chǎn)酸能力不同，且產(chǎn)酸強(qiáng)弱會影響發(fā)酵乳的口感、風(fēng)味和質(zhì)量等，較弱的菌株將失去利用價(jià)值[28]。只有產(chǎn)酸速率適中的菌株，才能滿足生產(chǎn)需求。由圖2可看出，在6 h前，所有菌株的產(chǎn)酸速率均增加緩慢，但在6 h后，產(chǎn)酸速率迅速增加，并在18 h后趨于穩(wěn)定。其中菌株HL30-3產(chǎn)酸速率速率最快，18 h內(nèi)酸度達(dá)到105.38 °T，表明該菌產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。在18 h內(nèi)，菌株HL12-21、HL29-5、HL21-44、HL29-1的酸度分別由24.43、23.84、20.58、19.48 °T增加到84.12、79.28、78.56、76 °T，這4 株菌的產(chǎn)酸速率較快，表明它們產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。菌株HL26-24和HL13-23的產(chǎn)酸速率較慢，在18 h后分別達(dá)到66、64.85 °T，二者產(chǎn)酸能力較弱，在生產(chǎn)中容易造成產(chǎn)品污染。

圖2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線Fig. 2 Acid production curves of seven LAB strains

2.3.3 后酸化能力測定結(jié)果

在貯藏期間，后酸化是影響酸乳感官品質(zhì)和風(fēng)味特性的重要因素，過度的產(chǎn)酸將使發(fā)酵乳酸度太高，大量乳清析出，降低了產(chǎn)品的貨架期[29]，因此需選后酸化較弱的菌株作為發(fā)酵劑。如圖3所示，4 ℃貯藏20 d后，7 株菌的酸度均呈上升的趨勢，其中菌株HL30-3的酸度增加了17 °T，變化最大，后酸化較強(qiáng)，可能造成酸乳品質(zhì)的下降和縮短貨架期；菌株HL26-24、HL13-23的酸度變化較小，分別增加了4.8、3.27 °T，且它們最終酸度也低于65 °T，可能與菌株自身產(chǎn)酸較低有關(guān)；其余4 株菌的酸度增幅一般，在5～8 °T之間，表明除菌株HL30-3外，其余6 株菌具有較好的抗后酸化能力，不會影響酸乳的風(fēng)味、口感和質(zhì)地等。

圖3 酸乳冷藏期間酸度的變化Fig. 3 Change in acidity of milks fermented with seven selected strains during cold storage

2.3.4 產(chǎn)香能力測定結(jié)果

乙醛和雙乙酰是構(gòu)成發(fā)酵乳典型風(fēng)味的重要物質(zhì)，可以依據(jù)二者的含量判斷菌株的產(chǎn)香能力[6]。此外，形成香味物質(zhì)的高峰一般在發(fā)酵結(jié)束后，但由于多種風(fēng)味物質(zhì)相互作用才能得到良好風(fēng)味，所以需要12～24 h才能完成其產(chǎn)香過程[18]，本實(shí)驗(yàn)的樣品為后熟1 d后的發(fā)酵乳。實(shí)驗(yàn)所得雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=0.121 5X+0.023 8（R2=0.999 1，Y為OD335nm，X為雙乙酰質(zhì)量濃度/（mg/L））。如圖4所示，菌株HL30-3、HL29-5、HL12-21、HL21-44和HL29-1的乙醛質(zhì)量濃度較高，分別為18.45、17.48、15.38、12.2 mg/L和11.3 mg/L，其余2 株菌均低于10 mg/L，據(jù)報(bào)道乙醛含量與酸度呈正相關(guān)[27]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之類似；7 株菌的雙乙酰質(zhì)量濃度較低，在2.28～4.8 mg/L之間，也有研究報(bào)道，產(chǎn)生香味物質(zhì)能力強(qiáng)的菌株，一般雙乙酰的含量較小[7]。除菌株HL13-23外，其余菌株的乙醛和雙乙酰含量的比例均高于3∶1，一般認(rèn)為乙醛與雙乙酰含量之比大于3∶1時(shí)，且乙醛含量越高，酸乳的風(fēng)味越好[29]，表明菌株HL30-3、HL29-5、HL12-21、HL21-44和HL29-1產(chǎn)香能力較好且制備的酸乳風(fēng)味較佳，這與感官評價(jià)結(jié)果類似。

圖4 菌株產(chǎn)香能力測定結(jié)果Fig. 4 Determination of aroma-producing capacity of the strains

2.3.5 發(fā)酵乳中活菌數(shù)分析

有研究表明，發(fā)酵乳的活菌數(shù)含量高于106CFU/mL才能在人體產(chǎn)生有益作用，也是體現(xiàn)活性乳酸菌制品具有保健功能的重要指標(biāo)之一[30]。如圖5所示，后熟1d后，所有菌株的活菌數(shù)均高于108CFU/mL，在1～4 d內(nèi)，活菌數(shù)達(dá)到最高，可能是這些菌在冷藏前期還具有活性能利用乳中的殘?zhí)?；隨著貯藏時(shí)間的延長，所有菌株的活菌數(shù)均呈下降趨勢，這是因?yàn)榫晁幗橘|(zhì)酸度較高，貯藏溫度低，抑制了它們的生長和繁殖。貯藏20 d后，除菌株HL26-24和HL13-23外，其余5 株菌株的活菌數(shù)仍高于106CFU/mL，滿足相應(yīng)的要求。

圖5 貯藏期間活菌數(shù)變化Fig. 5 Changes in viable bacterial count during storage

2.4 菌株益生特性

2.4.1 模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌進(jìn)行模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)?zāi)芨玫胤从尘暝谖改c道環(huán)境中的存活情況，對胃腸液的耐受性是潛在益生菌的重要特性，菌株在受到胃酸（低pH值）和腸道環(huán)境（膽鹽和胰酶）的影響后，保持足夠數(shù)量對乳品工業(yè)的應(yīng)用也非常重要[31]。對7 株菌與鼠李糖乳桿菌GG進(jìn)行模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。菌株在模擬胃液中均能較好地存活，其中HL29-1、HL30-3、HL29-5和鼠李糖乳桿菌GG的存活情況最好，經(jīng)過180 min處理后的活菌數(shù)仍在107CFU/mL以上。此外，相比模擬胃液而言，模擬腸液對菌株的影響更顯著。在模擬腸液中處理120 min后，除HL26-24和鼠李糖乳桿菌GG的活菌數(shù)降低至107～108CFU/mL外，其余6 株菌的活菌數(shù)在108CFU/mL以上；處理240 min后，活菌數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中HL12-21、HL21-44和HL29-5的活菌數(shù)降低至107～108CFU/mL，其余菌的活菌數(shù)降低至107CFU/mL以下。因?yàn)閷Φ蚿H值或高膽汁的抗性機(jī)制取決于物種和菌株[32]，部分菌株的模擬胃腸液耐受性差異明顯。綜合模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與鼠李糖乳桿菌GG相比，菌株HL12-21、HL13-23、HL21-44、HL30-3和HL29-5能在胃腸道環(huán)境中較好地生存。

表2 乳酸菌在模擬胃液和腸液中的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 Viable counts of lactic acid bacteria when exposed to simulated gastric and intestinal juice lg（CFU/mL）

2.4.2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)較多，如H2O2、有機(jī)酸、CO2和細(xì)菌素等[33]。本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)調(diào)酸處理的CFCS以及在調(diào)酸基礎(chǔ)上加入蛋白酶K的CFCS對致病菌進(jìn)行抑菌能力的測定，結(jié)果見圖6，顏色從藍(lán)色到紅色的漸變過程代表了抑菌圈直徑的遞增。經(jīng)排酸處理后，由熱圖橫向看，相比鼠李糖乳桿菌GG，菌株HL30-3、HL13-23和HL29-5的紅、橙色區(qū)域最多且無深藍(lán)色區(qū)域，表明這3 株菌的抑菌譜較廣及抑菌能力更強(qiáng)；而其余菌株多為藍(lán)色區(qū)域，表明它們抑菌譜較窄且抑菌能力一般?？v向看，紅、橙色區(qū)域主要集中在EC1、EC2、LS1和SA的區(qū)域中，表明大部分菌株對致病性、腸毒素性大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌能力。

當(dāng)在調(diào)酸基礎(chǔ)上加入蛋白酶K處理后，由圖6可知，菌株HL30-3和HL29-5的大多數(shù)顏色區(qū)域變?yōu)樗{(lán)色，而其余菌株的顏色區(qū)域變化較小。由于抗菌化合物可以競爭性排斥病原體在腸道的生存和表達(dá)，且對蛋白酶敏感[21]，因此菌株HL30-3和HL29-5的抑菌作用可能源自發(fā)酵過程產(chǎn)生的類細(xì)菌素，而其余菌的抑菌作用可能主要源自H2O2和CO2等，且抑菌活性可能依賴于物種和菌株[34]。總體來說，與鼠李糖乳桿菌GG相比，菌株HL30-3、HL13-23和HL29-5抑菌能力強(qiáng)。

圖6 基于抑菌圈直徑對乳酸菌抑菌能力的熱圖分析Fig. 6 Heatmap analysis of anti-pathogen activity of lactic acid bacteria based on the diameters of the zone of inhibition

2.4.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

益生菌對抗生素的耐受性會對人體安全性產(chǎn)生較大影響[35]。益生菌在拮抗致病菌時(shí)，若耐藥性基因轉(zhuǎn)移到致病菌后，致病菌將產(chǎn)生耐藥性[23]。即使乳酸菌被廣泛認(rèn)為是安全的，但仍需評估其安全性。選用20 種常見抗生素對8 株菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果判定參照CLSI 2015版標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，結(jié)果見圖7。熱圖通過不同的顏色梯度表示抑菌圈直徑大小，可反映出乳酸菌的抗生素耐藥情況，顏色從紅色到藍(lán)色的過程代表抑菌圈直徑的遞減，整體可知，藍(lán)色區(qū)域主要集中在卡那霉素、阿卡米星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、多黏菌素、萬古霉素和替考拉林，表明這7 種抗生素對大部分菌株無抑制作用，表現(xiàn)出耐藥性，菌株對卡那霉素的耐藥性已經(jīng)在部分研究中報(bào)道過，可能是缺乏細(xì)胞色素介導(dǎo)的藥物吸收電子傳遞機(jī)制和細(xì)胞膜的不滲透性造成[21]，對萬古霉素的耐藥性被認(rèn)為是由于D-Ala-D-lactate取代了存在于肽聚糖中的正常靶標(biāo)D-Ala-D-Ala[36]，對其他抗生素的耐藥性可能是由于該抗生素在乳酸菌細(xì)胞中缺乏靶位。橫向看，菌株HL30-3、HL29-5和鼠李糖乳桿菌GG的大部分區(qū)域處在紅、綠色之間，表明大部分抗生素對這3 株菌有抑制作用；菌株HL21-44、HL26-24和HL29-1部分區(qū)域處在紅、綠色之間，表明部分抗生素對它們有抑制作用；菌株HL12-21和HL13-23較多區(qū)域?yàn)樗{(lán)色，表明它們對較多抗生素產(chǎn)生耐藥性。縱向看，頭孢噻肟、四環(huán)素、米諾環(huán)素、利福平、氯霉素、紅霉素、克林霉素、羥氨芐青霉素、青霉素、苯唑西林、鏈霉素、氯芐西林、慶大霉素的大部分區(qū)域處在紅、綠色之間，即大部分菌株對它們表現(xiàn)敏感或中度敏感，證實(shí)了乳酸菌對這些抗生素的耐藥性普遍較低，與相關(guān)的研究報(bào)道一致[37]；而其余7 種抗生素的大部分區(qū)域?yàn)樗{(lán)色，即大部分菌株對它們表現(xiàn)耐藥。

圖7 基于抑菌圈直徑對乳酸菌的抗生素耐藥性的熱圖分析Fig. 7 Heatmap analysis of the antibiotic tolerance of lactic acid bacteria based on the diameters of the zone of inhibition

2.4.4 抗氧化活性測定結(jié)果

機(jī)體內(nèi)的羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基等自由基氧化性強(qiáng)，產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)、小細(xì)胞分子等損傷，進(jìn)而對機(jī)體造成氧化損傷[38]。因此，評價(jià)菌株的抗氧化活性極其重要。有研究報(bào)道，僅通過單一自由基清除率判定菌株的抗氧化活性準(zhǔn)確性不高，為提高結(jié)果的有效性，可綜合對多種自由基的清除率判定[25]。采用乳酸菌的活細(xì)胞懸浮液進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示，菌濃度為109CFU/mL時(shí)，8 株菌對3種自由基均有一定的清除能力，清除率均超過10%，表明它們具有一定的抗氧化活性，可能是因?yàn)檫@些菌株的細(xì)胞內(nèi)存在金屬離子Cu2+和Fe2+等天然螯合劑，金屬離子被螯合后，使過氧化反應(yīng)減緩及細(xì)胞表面存在的蛋白質(zhì)、多糖等化合物具有清除自由基的作用[39-40]。對比3種自由基清除率，8 株菌對超氧陰離子自由基的清除率最高，可能是菌體產(chǎn)生較多的超氧化物歧化酶，而該酶具有清除超氧陰離子自由基的能力[38]。此外，與標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠李糖乳桿菌GG相比，菌株HL21-44、HL29-5和HL30-3對3種自由基的清除率均較高且超過30%，表明這3 株菌的抗氧化活性強(qiáng)于對照菌株?？寡趸钚院玫木昕勺鳛闈撛诘目寡趸陸?yīng)用于功能食品開發(fā)，有助于預(yù)防和控制氧化應(yīng)激相關(guān)疾病。

圖8 菌株的抗氧化活性Fig. 8 Antioxidant activity of the strains

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合乳酸菌的傳統(tǒng)分離鑒定方法，從新疆哈密地區(qū)采集的驢乳中純化分離出38 株疑似乳酸菌，其中7 株菌具有明顯凝乳性能，經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定菌株HL12-21、HL29-5、HL30-3、HL21-44、HL26-24、HL29-1和HL13-23分別為P. acidilactici、P. pentosaceus、E. mundtii、L. plantarum、L. coryniformis、L. curvatus和L. lactis。對7 株菌的凝乳時(shí)間、產(chǎn)酸能力、后酸化能力、產(chǎn)香能力、感官特性和冷藏期間活菌數(shù)等指標(biāo)檢測顯示，7 株菌的凝乳時(shí)間短，其中菌株HL30-3具有較好的產(chǎn)酸、產(chǎn)香能力，但后酸化過強(qiáng)可能造成酸乳品質(zhì)的下降和縮短貨架期；菌株HL13-23和HL26-24具有較弱的后酸化，但產(chǎn)酸和產(chǎn)香能力較差，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需求；菌株HL12-21、HL29-5、HL21-44和HL29-1具有更好的產(chǎn)酸、產(chǎn)香能力及弱的后酸化，單菌發(fā)酵乳的色澤、質(zhì)地及風(fēng)味綜合評分最高，且4 ℃貯藏20 d后，活菌數(shù)仍保持在106CFU/mL以上，符合優(yōu)良發(fā)酵劑的基本特征。此外，比較了7 株分離菌株和益生菌鼠李糖乳桿菌GG對模擬胃腸液的耐受性，以及抑菌譜、抗生素耐藥、抗氧化活性，結(jié)果表明菌株HL29-5和HL30-3對以上益生菌篩選指標(biāo)表現(xiàn)更優(yōu)，尤其對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率最高（超過30%）。本研究表明驢乳是篩選優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑的良好來源，其中P. pentosaceusHL29-5具有作為益生性發(fā)酵劑的潛力，并為后續(xù)研發(fā)具有地域特色的發(fā)酵乳制品提供了菌株資源，為推動(dòng)當(dāng)?shù)厝槠沸袠I(yè)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。