劉照宇，劉新婷，白新宇，李 雯，曾教科

（海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南 ?？?570228）

黃皮（Clausena lansium(Lour.) Skeels），屬蕓香科黃皮屬，為原產(chǎn)于我國華南地區(qū)的特色水果，海南為主產(chǎn)區(qū)之一[1]。黃皮果實風(fēng)味獨特，具有較高的營養(yǎng)價值，可鮮食、加工以及藥用，因而深得消費者喜愛[2-4]。黃皮前期的研究主要集中在種質(zhì)資源和生理生化，包括采前品種的形態(tài)和理化性狀、物候期、抗性、種質(zhì)資源和育種等方面[5-7]，采后的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性功能[2,8-9]，以及采后保鮮處理技術(shù)等[10-12]。而對黃皮果實分子層面的研究甚少，目前主要集中在一些基因的克隆及分子標(biāo)記等方面[7,13-15]。

黃皮果實屬于非呼吸躍變型，但果實在采后貯運過程中，生理代謝活動旺盛，導(dǎo)致果實成熟與衰老加速，品質(zhì)劣變迅速。且黃皮果肉柔軟多汁，果皮較薄，采后1～2 d即發(fā)生褐變，商品性下降。黃皮果實采后褐變主要是由多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）引起的酶促褐變，不同采后處理技術(shù)措施如低溫[16]、熱處理[17]和殼聚糖浸泡[18]等均可以在一定程度上提高黃皮果實超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶活性，從而抑制PPO活性，減緩褐變的發(fā)生。本實驗前期的研究結(jié)果也顯示，采后熱激（heat treatment，HT）和程序降溫（low temperature conditioning，LTC）處理可以有效提高抗氧化酶SOD、PAL和POD等活性，從而抑制黃皮果實褐變，維持果實品質(zhì)[11-12]。但是，對黃皮抗氧化酶編碼基因的研究報道較少，研究進展緩慢，因此，有必要通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)挖掘黃皮果實抗氧化酶編碼基因。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)可用于在mRNA水平上鑒定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），從而解釋園藝學(xué)科中一些理論和現(xiàn)象，果實采后成熟衰老過程中基因的變化可以通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析進行研究。如Liu Xia等[19]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了鮮棗果實采后表皮凹陷，篩選出1 210 個DEGs響應(yīng)表皮凹陷，這些基因主要參與了碳水化合物代謝和苯丙烷途徑等。Terol等[20]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控柑橘果實早熟。Li Xin等[21]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了火龍果采后抗氧化機制的關(guān)鍵基因。而在黃皮果實轉(zhuǎn)錄組研究中，陸育生等[7]報道了利用黃皮轉(zhuǎn)錄組進行SSR挖掘和密碼子偏好性分析，但對黃皮果實采后品質(zhì)和抗氧化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組研究鮮見報道。

本實驗采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對HT（50 ℃/30 s）、LTC（8 ℃/4 d）和對照（CK）（3 ℃）處理后3 ℃貯藏至第6天的黃皮果實進行測序，擬從轉(zhuǎn)錄組水平分析黃皮果實在不同處理技術(shù)下基因的表達差異，進而對DEGs進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，同時篩選出抗氧化相關(guān)的DEGs，旨在為今后黃皮果實褐變的調(diào)控研究和品質(zhì)維持提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃皮果實（“大雞心”品種）采自海南省?？谑杏琅d鎮(zhèn)黃皮果園，在商業(yè)采收期采收，挑選大小、色澤、形狀一致，無機械損傷及病蟲害的果實，立即運回實驗室進行處理。

氫氧化鈉、酚酞、95%乙醇溶液、碳酸氫鈉、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創(chuàng)木酚、核黃素、30%過氧化氫溶液、甲硫氨酸、氮藍四唑、EDTA-Na2、福林-酚試劑、碳酸鈉、沒食子酸、DPPH、無水甲醇西隴化工股份有限公司。所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；2100生物分析儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

本實驗共分為3個處理：1）CK：果實直接低溫3 ℃貯藏；2）HT：50 ℃熱水浸泡30 s后轉(zhuǎn)到3 ℃貯藏；3）LTC：果實在8 ℃預(yù)貯4 d后轉(zhuǎn)到3 ℃貯藏。以采收當(dāng)天為貯藏第0天，果實處理后貯藏至第8天，每2 d進行生理指標(biāo)測定和凍樣，每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)10 個果實；另每個處理單獨留取50 個果實，用于質(zhì)量損失率及褐變指數(shù)的測定。

1.3.2 質(zhì)量損失率與褐變指數(shù)測定

參考常文俊[12]的方法。

質(zhì)量損失率采用稱質(zhì)量法，使用與0 d比較的相對質(zhì)量損失表示，用式（1）計算：

果實褐變指數(shù)采用分級法測定。每個處理隨機選取50 個黃皮果實進行褐變指數(shù)的觀察。將黃皮褐變程度分為5個等級：1級果：褐變面積＜1/4，2級果：1/4≤褐變面積＜1/2，3級果：1/2≤褐變面積＜3/4，4級果：褐變面積≥3/4，5級果為完全褐變的黃皮果實。

1.3.3 抗氧化酶與抗氧化活性測定

SOD活性使用氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）光還原法[22]進行測定。稱取2.0 g黃皮果肉，加入5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.8）冰浴研磨至勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液待用。取0.1 mL上清液加入反應(yīng)體系（50 mmol/L磷酸緩沖液，130 mmol/L甲硫氨酸溶液，750 μmol/L NBT溶液，100 μmol/L EDTA-Na2溶液，20 μmol/L核黃素溶液），搖勻，將試管置于4 000 lx白光條件下顯色反應(yīng)30 min，每15 min轉(zhuǎn)管一次。以暗中對照管作空白（調(diào)零），在560 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度，以每分鐘NBT光還原抑制50%為1個酶活力單位，SOD活性用U/g表示。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。

CAT活性的測定采用紫外分光光度法[23]。稱取2.0 g果肉，加入磷酸鈉緩沖液（pH 7.0，含0.05%聚乙烯吡咯烷酮）中研磨至勻漿后，12 000 r/min離心20 min，收集上清液待用。取0.1 mL提取液，加入2.9 mL 10 mmol/L的H2O2溶液，在240 nm波長處測定3 min內(nèi)吸光度的變化，以磷酸鈉緩沖液為空白對照（調(diào)零），以每分鐘吸光度減少0.01為1個酶活力單位，CAT活性用U/g表示。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。

POD活性的測定參考愈創(chuàng)木酚法[24]。稱取2.0 g果肉，加入5 mL 0.1 mol/L乙酸緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L聚乙二醇、4%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和1% TritonX-100）冰浴研磨至勻漿后，在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液待用。取0.2 mL提取液，加入3 mL愈創(chuàng)木酚和0.2 mL H2O2溶液，在470 nm波長處測定1 min內(nèi)吸光度的變化，以蒸餾水代替提取液為空白對照（調(diào)零），以每分鐘變化0.01為1個酶活力單位，POD活性用U/g表示。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。

抗氧化活性使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定方法[25]。稱取2.0 g果肉，加入少量石英砂和5 mL 1%鹽酸-甲醇溶液冰浴研磨至勻漿，后定容至25 mL，4 ℃避光靜置20 min，收集上清液。取0.1 mL提取液，加入2.9 mL 10 μmol/L的DPPH溶液，避光靜置30 min，測定517 nm波長處的吸光度為As，以超純水代替提取液作為對照，測定吸光度Ac，以無水乙醇代替DPPH作為空白對照，測定吸光度為Ao，DPPH自由基清除率按式（3）計算：

1.3.4 RNA提取與文庫建立

根據(jù)褐變指數(shù)、抗氧化酶和抗氧化活性等結(jié)果分析，從貯藏第6天開始，HT和LTC處理促進抗氧化活性的提高。因此，選擇貯藏第0天（編號0 d）和第6天（編號CK-6 d、HT-6 d、LTC-6 d）的黃皮果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。采用RNA prep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取果實RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop微量紫外分光光度計和2100生物分析儀檢測RNA樣品的濃度、純度和完整性。樣品檢測合格后，由廣州賽哲生物科技股份有限公司進行cDNA文庫構(gòu)建，并對構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeqTM進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

1.3.5.1 序列組裝與功能注釋

使用Trinity 2.2.0對所得過濾后的轉(zhuǎn)錄組reads數(shù)據(jù)進行拼接為contigs，將contigs連接得到scaffold，篩選掉含N片段得到Unigene庫。使用BLASTX將所有組裝的Unigene序列與Nr（http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NCBI non-redundant protein sequences）、Swiss-Prot protein database、KEGG（http://www.genome.jp/kegg）、直系同源群集（Clusters of Orthologous Group，COG）/KOG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）等數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對（E-value＜10-5），得到具有較高相似性的蛋白序列，從而得到Unigene對應(yīng)的蛋白功能注釋信息。

1.3.5.2 DEGs篩選及聚類分析

使用RSEM（RNA-Seq by Expectation-Maximization）軟件做定量分析，基因表達量使用FPKM（fragments per kilobase of exon per million mappedfragments）表示[26]。然后使用edgeR軟件（v3.14.0）篩選DEGs，篩選條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05且|log2FC|＞1。其中FDR通過對差異顯著性P值進行校正得到；差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示所對比的樣品間FPKM比值，log2FC為正值表明基因上調(diào)，反之則為下調(diào)。

聚類分析用于判斷DEGs在不同處理條件下的表達模式。以不同處理DEGs的FPKM值為表達水平，做層次聚類分析，不同顏色的區(qū)域代表不同的聚類分組信息，同組內(nèi)的基因表達模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過程。

1.3.5.3 GO富集分析和通路富集分析

根據(jù)Unigene的Nr注釋，使用BLAST2GO軟件獲取Unigene的GO信息，使用WEGO進行分類統(tǒng)計。通路顯著性富集分析以KEGG通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出DEGs相對于所有有注釋基因顯著富集的通路。以KEGG通路為單位，使用KOBAS進行通路富集分析。使用Pfam數(shù)據(jù)庫對序列進行對比，確定基因類型，若Pfam無法預(yù)測，則使用基因功能確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007和SPSS 16.0等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用ggplot2包及pheatmap包作圖。使用R語言進行相關(guān)性分析，并使用ggcorrplot作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HT和LTC處理對黃皮果實質(zhì)量損失與褐變的影響

由圖1可知，黃皮的質(zhì)量損失率和褐變指數(shù)隨貯藏時間延長整體呈上升趨勢，LTC處理可以顯著降低黃皮貯藏期間的質(zhì)量損失率，而HT處理與CK相比差異不顯著（圖1A）。與CK相比，LTC處理也可以顯著降低黃皮果實褐變指數(shù)，而HT處理的黃皮果實在貯藏第6天后才有顯著差異（圖1B），因此，LTC處理是一種有效的抑制黃皮果實失水和褐變的調(diào)控措施。這與枇杷[27]、梨[28]、桃[29]等其他水果上的研究結(jié)果基本一致，LTC處理可有效減少果實采后失水，延緩褐變，從而延長貯藏壽命。

圖1 HT和LTC處理對黃皮果實質(zhì)量損失（A）與褐變（B）的影響Fig. 1 Effects of HT and LTC treatment on mass loss (A) and browning (B) of wampee fruit

2.2 HT和LTC處理對黃皮果實抗氧化酶和抗氧化活性的影響

研究表明，黃皮果實采后衰老主要由褐變引起，而褐變主要由酚類物質(zhì)的氧化導(dǎo)致[12]，因此，通過采后處理提高抗氧化能力（抑制酚類氧化）是一種有效延緩黃皮果實褐變的措施。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，黃皮果實抗氧化酶活性均有不同程度的升高。CK組果實SOD和POD活性在貯藏第6天達到峰值，之后開始下降，至貯藏第8天時，明顯低于HT和LTC處理組果實。CK組果實CAT活性和DPPH自由基清除率則在貯藏第4天達到峰值，至貯藏第6天開始，顯著低于HT和LTC處理組果實。說明HT和LTC處理可顯著推遲抗氧化酶和抗氧化活性高峰的出現(xiàn)，維持黃皮果實貯藏中后期較高的抗氧化性能，從而延緩褐變的進程，這與周開兵[17]和常文俊[11]等的研究結(jié)果類似，HT或LTC處理可以提高黃皮果實抗氧化酶活性，增強自由基清除能力，從而延長黃皮貯藏或貨架壽命。類似的結(jié)果也在黃瓜和荔枝上得到證實，Wang Bin等[30]研究表明，貯前冷馴化（類似LTC）處理，可有效增強黃瓜抗氧化酶活性和基因表達，并且抗氧化酶及基因的變化在被誘導(dǎo)激活前有一個轉(zhuǎn)變點，表明足夠有效的抗氧化酶是低溫貯藏所必需。Zhang Zhengke等[31]研究也發(fā)現(xiàn)，蘋果多酚處理顯著推遲荔枝果實SOD和POD活性高峰的出現(xiàn)，從而延緩貯藏中期褐變的發(fā)生。

圖2 HT和LTC處理對黃皮果實抗氧化酶和抗氧化活性的影響Fig. 2 Effects of HT and LTC treatment on antioxidant enzyme activities and antioxidant activity in wampee fruit during storage

2.3 RNA樣品質(zhì)量檢測

根據(jù)測序公司要求，對提取的RNA樣品進行濃度、純度和完整性檢測。如圖3所示，所有RNA樣品的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.1之間，RNA完整值高于6.5，28S/18S核糖體亞基比率大于1。樣品檢測符合測序公司要求，可進行cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳（A）和生物分析儀（B）檢測RNA樣品質(zhì)量Fig. 3 Evaluation of RNA quality by agarose gel electrophoresis (A)and Agilent 2100 bioanalyzer (B)

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝及分析

黃皮轉(zhuǎn)錄組測序共獲得348 795 114 條原始reads，平均每個文庫29 066 260 條；篩選過濾后獲得345 649 476 條clean reads，占原始reads中99.1%，平均每個文庫28 804 123 條，每個文庫都產(chǎn)生超過3 G的clean bases，Q20的比例都超過96%，Q30都超過90%，說明測序質(zhì)量較好。通過Trinity進行de novo組裝后，從12個文庫中共得到35 421個轉(zhuǎn)錄本，N50為1 744 bp，平均長度為1 208 bp，GC占比41.14%；獲得27 353 條Unigene，N50為1 731 bp，平均長度1 138 bp，GC占比41.33%。其中在CK、HT和LTC中均表達的Unigene有20 219 個。

表1 黃皮轉(zhuǎn)錄組組裝信息Table 1 Statistics of transcriptome assembly information of wampee

2.5 Unigene功能注釋及分析

將得到的Unigene與Nr、Swiss-prot protein database、KEGG、COG/KOG等數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較，獲取Unigene注釋信息。將四大數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene通過Venn圖分析不同Unigene與數(shù)據(jù)庫之間的關(guān)系。分析得出，不同數(shù)據(jù)庫都注釋到的Unigene數(shù)為6 533 條，占注釋Unigene總數(shù)的23.9%（圖4A）。21 696 條Unigene被至少一個數(shù)據(jù)庫成功注釋，占全部Unigene的79.32%。Nr數(shù)據(jù)庫比對注釋獲得的Unigene數(shù)最多，有21 658 條，占了Unigene總數(shù)的34%。其中有15 841 條Unigene比對到Swissport數(shù)據(jù)庫。用于KEGG途徑和KOG分析的分別有8 044 條和13 097 條Unigene（圖4B）。轉(zhuǎn)錄本注釋比例均高于Unigene，說明大部分基因得以注釋（圖4C）。37.95%的Unigene（10 381）與臍橙（Citrus sinensis）基因序列相似，其次是可可（6.59%，Theobroma cacao，1 802）和土瓶草（5.15%，Cephalotus follicularis，1 408）（圖4D）?？勺⑨尰蚪^大部分來自于同屬蕓香科的臍橙和同為熱帶植物的可可，注釋結(jié)果可靠性較高。

圖4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)功能注釋與分析Fig. 4 Functional annotation of RNA-Seq data for each database

2.6 DEGs篩選結(jié)果

為篩選出DEGs，將CK-0 d vs CK-6 d、CK-6 d vs HT-6 d、CK-6 d vs LTC-6 d轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別進行比較。由圖5可知，CK-0 d vs CK-6 d，共篩選出9 342個DEGs，其中CK-6 d組相對于CK-0 d組下調(diào)表達基因3 800 個，占總差異表達40.7%，上調(diào)表達基因5 542個，占總差異表達59.3%。CK-6 d vs HT-6 d，共篩選出1 631個DEGs，其中HT-6 d下調(diào)表達基因754個，占總差異表達46.2%，上調(diào)表達基因877個，占總差異表達53.8%。CK-6 d vs LTC-6 d，共篩選出5 404個DEGs，其中LTC-6 d下調(diào)表達基因3 097個，占總差異表達57.3%，上調(diào)表達基因2 307個，占總差異表達42.7%。

圖5 CK-0 d vs CK-6 d（A）、CK-6 d vs HT-6 d（B）、CK-6 d vs LTC-6 d（C）對比DEGs火山圖和DEGs數(shù)量（D）Fig. 5 Volcano plots of DEGs in control group on day 0 versus day 6 (A),control group on day 6 versus HT group on day 6 (B), control group on day 6 versus LTC group on day 6 (C), and barplot of DEGs number (D)

2.7 DEGs GO富集分析

對不同處理的黃皮果實產(chǎn)生的DEGs進行GO富集分析。由圖6可知，對CK-0 d vs CK-6 d、CK-6 d vs HT-6 d、CK-6 d vs LTC-6 d進行顯著富集，發(fā)現(xiàn)3 組比較中DEGs在分子功能、生物過程和細胞組成三大功能類別均有分布。3 組比較產(chǎn)生的DEGs在GO富集分析中呈現(xiàn)一定共性，在生物過程類別中，DEGs主要富集在代謝過程、細胞過程、單細胞體過程；在細胞組分中，DEGs主要富集在細胞、細胞膜、細胞器；在分子功能中，DEGs主要富集在催化活性、結(jié)合。DEGs在代謝過程、細胞器、催化活性等的功能分類，說明HT、LTC處理改變了黃皮果實內(nèi)部的代謝和酶的催化功能。

2.8 DEGs通路顯著性富集分析

對3 組比較產(chǎn)生的DEGs繼續(xù)進行通路顯著性富集分析，CK-0 d vs CK-6 d共有1 392個基因被注釋到126 條KEGG代謝通路中；CK-6 d vs HT-6 d組有208個基因被注釋到86 條KEGG代謝通路中；CK-6 d vs LTC-6 d組有747個基因被注釋到122 條KEGG代謝通路中。如表2所示，3 組比較中都顯著富集的代謝通路有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖代謝和次生代謝產(chǎn)物生物合成等，這些途徑大多與黃皮果實采后生理代謝相關(guān)。并且，苯丙素生物合成、黃酮類化合物的生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑與黃皮果實抗氧化物質(zhì)代謝相關(guān)，可能參與了黃皮果實采后氧化褐變調(diào)控。

表2 黃皮褐變相關(guān)通路（P＜0.05）Table 2 Pathways related to the browning process of wampee fruit (P ＜ 0.05)

圖6 CK-0 d vs CK-6 d（A）、CK-6 d vs HT-6 d（B）和CK-6 d vs LTC-6 d（C）中DEGs的GO富集結(jié)果Fig. 6 GO enrichment of DEGs in control group on day 0 versus day 6 (A), control group on day 6 versus HT group on day 6 (B), and control group on day 6 versus LTC group on day 6 (C)

2.9 抗氧化相關(guān)基因篩選與差異表達

PAL、SOD、CAT、POD、APX、GR、GPX和GST等為常見的抗氧化酶編碼基因，在抑制果實褐變、品質(zhì)劣變等方面起著重要的作用[32-35]。為了進一步分析在不同處理條件下誘導(dǎo)差異表達的抗氧化酶編碼基因，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出了76個抗氧化相關(guān)DEGs（圖7），其中，CK-0 d vs CK-6 d比較有62個抗氧化相關(guān)基因，CK-6 d相對于CK-0 d下調(diào)基因17個，上調(diào)基因45個；CK-6 d vs HT-6 d比較有7個抗氧化相關(guān)基因，HT-6 d下調(diào)基因4個，上調(diào)基因3個；CK-6 d vs LTC-6 d比較有31個抗氧化相關(guān)基因，LTC-6 d下調(diào)基因24個，上調(diào)基因7個；HT-6 d vs LTC-6 d比較有34個抗氧化相關(guān)基因，LTC-6 d下調(diào)基因26個，上調(diào)基因8個。在4 組對比中可以發(fā)現(xiàn)，抗氧化基因在0 d和6 d中、不同處理中均存在差異表達。不同的抗氧化基因可能受不同處理誘導(dǎo)而參與黃皮果實品質(zhì)劣變過程。

圖7 4 組對比抗氧化性相關(guān)DEGs數(shù)目Fig. 7 Number of up-regulated and down-regulated genes associated with antioxidant activity

利用基因表達量熱圖，進一步分析這76個抗氧化相關(guān)基因的差異表達模式（圖8A）。結(jié)果顯示，第I、II類基因均在黃皮貯藏過程中下調(diào)表達，說明這兩類基因可能與黃皮果實采后正常衰老過程有關(guān)。與CK相比，HT和LTC處理均顯著抑制了第IV類基因（1個PAL基因、4個POD基因、1個GPX基因、7個GST基因）表達的上升，并與黃皮果實貯藏前期抗氧化酶活性的變化趨勢一致；相關(guān)性分析表明，第IV類基因與抗氧化活性（DPPH自由基清除率）呈負相關(guān)或相關(guān)性較小，而與褐變指數(shù)正相關(guān)（圖8B），說明第IV類基因可能通過降低貯藏前期抗氧化活性強度，從而維持貯藏中后期較高的總抗氧化活性，達到延緩褐變的效果。HT處理顯著誘導(dǎo)第V類基因（1個CAT基因、1個POD基因、3個GST基因、1個APX基因）的上調(diào)表達，LTC處理顯著誘導(dǎo)第VII（3個POD基因、2個SOD基因、1個GST基因）和X類基因（2個POD基因、2個APX基因、1個GST基因、1個GPX基因）的上調(diào)表達，相關(guān)性分析表明，第VII類基因與DPPH自由基清除率正相關(guān)或相關(guān)性不顯著，而與褐變指數(shù)負相關(guān)或相關(guān)性不顯著（圖8B），說明這一類基因可能不是控制褐變的關(guān)鍵基因；第V、X類基因均與DPPH自由基清除率和褐變指數(shù)正相關(guān)（圖8B），說明這兩類基因可能在黃皮果實中后期發(fā)揮作用，參與褐變的抑制。

圖8 黃皮果實抗氧化相關(guān)DEGs表達量熱圖（A）及其與抗氧化和褐變相關(guān)性分析（B）Fig. 8 Heatmap analysis of antioxidation-related DEGs (A) and their correlation with antioxidant activity and browning (B) in wampee fruit

HT和LTC處理對果實抗氧化酶活性及相關(guān)基因誘導(dǎo)的效果與其他果實報道類似，Huan Chen等[36]研究表明，HT處理可上調(diào)SOD、CAT、APX等抗氧化相關(guān)基因表達，延緩桃果實采后低溫貯藏過程中的褐變。Li Xia等[37]研究表明，LTC處理可通過持續(xù)誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性，從而延緩紅薯褐變的發(fā)生。說明提高抗氧化活性是延緩果實褐變發(fā)生的重要途徑，相關(guān)研究報道，冷馴化[30]、乙醇[38]、UV-C[39]、蘋果多酚[31]和褪黑素[40]等處理均可通過增強SOD、POD、CAT等酶和抗氧化活性，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達，從而延緩果實褐變的發(fā)生。

3 結(jié) 論

本實驗采用HT（50 ℃/30 s）、LTC（8 ℃/4 d）和CK（3 ℃）處理黃皮果實并3 ℃貯藏，發(fā)現(xiàn)LTC處理能有效抑制黃皮果實失水和褐變，HT和LTC處理可以顯著推遲黃皮果實抗氧化酶和抗氧化活性高峰的出現(xiàn)，增強自由基清除能力，從而延長貯藏或貨架壽命。對第0天和第6天的黃皮果實RNA進行測序分析，共得到35 421個轉(zhuǎn)錄本；并在CK-6 d vs HT-6 d和CK-6 d vs LTC-6 d中分別發(fā)現(xiàn)1 631個和5 404個DEGs。GO富集分析結(jié)果顯示，這些DEG主要集中在生物過程中的代謝過程、分子過程。KEGG通路富集分析這些DEGs主要集中于苯丙素生物合成、黃酮類化合物的生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。從黃皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到76個抗氧化酶相關(guān)編碼基因，基因表達量熱圖和相關(guān)性分析結(jié)果表明，這76個基因的表達模式可以聚為10 類。HT和LTC處理通過抑制第IV類基因表達的上升，降低黃皮果實貯藏前期抗氧化活性強度，從而維持貯藏后期較高的總抗氧化活性延緩褐變的發(fā)生。HT和LTC處理分別通過誘導(dǎo)第V類和第X類基因的表達，增強貯藏后期抗氧化活性，從而達到延緩褐變發(fā)生。因此，HT和LTC分別通過不同的途徑提高黃皮果實貯藏過程中的抗氧化能力，其中第IV、V、X類基因可能為抑制黃皮褐變的關(guān)鍵基因。本研究為黃皮的品種選育和品種改良等提供理論基礎(chǔ)。