醬香型酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群和稀有菌群對(duì)細(xì)菌總?cè)郝溲萏婺Ｊ降挠绊?/h1>
2022-02-16 09:27:04吳福勇李芳香鐘艷霞莫新良王新葉
食品科學(xué) 2022年2期
趙 亮，閔 卓，吳福勇，江 璐，李芳香，鐘艷霞，張 陽(yáng)，莫新良，何 惠，王新葉
（茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州 遵義 564507）
堆積發(fā)酵是醬香白酒釀造的獨(dú)特關(guān)鍵工序，屬于邊糖化、邊發(fā)酵方式。高溫大曲的曲藥微生物能在酒醅上增殖、發(fā)酵，同時(shí)高溫堆積網(wǎng)羅、富集環(huán)境空氣中的微生物，生成醬香或醬香前體物質(zhì)，為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件，相當(dāng)于“二次制曲”[1-5]，也為入窖發(fā)酵提供糖化基礎(chǔ)和微生物儲(chǔ)備[6-7]。
醬香型白酒中最重要且研究最多的微生物類(lèi)群是細(xì)菌，其主要來(lái)自于高溫制曲和堆積工序。細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物在高溫操作過(guò)程中強(qiáng)化了糟醅自身形成醬香的原動(dòng)力，促進(jìn)醬香物質(zhì)的進(jìn)一步生成[8]。因此，堆積發(fā)酵的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其變化對(duì)后期窖內(nèi)產(chǎn)酒和生香具有舉足輕重的作用，而研究醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)是解析發(fā)酵機(jī)理和風(fēng)味形成的基礎(chǔ)保障[5]，在近幾年引起眾多學(xué)者的關(guān)注。程才瓔等[9]使用變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析了醬香型白酒7個(gè)輪次細(xì)菌分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)同一輪次堆積發(fā)酵的前期、后期和中期多樣性依此增大，Bacillus、Thermoactinomycetaceae、Staphylococcus、Virgibacillus、Lactobacillus、Corynebacterium、Streptomyces、Lentibacillus及一些不可培養(yǎng)類(lèi)群為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群。Wang Li等[10]使用高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Bacillaceae和Lactobacillales分別為堆積前期和窖內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群，并且多數(shù)來(lái)自大曲的細(xì)菌對(duì)堆積發(fā)酵前期的群落結(jié)構(gòu)形成有重要作用。戴奕杰等[8]使用HTS技術(shù)分析醬香型酒醅整個(gè)生產(chǎn)周期所有輪次細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在產(chǎn)酒發(fā)酵階段Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium_sensu_stricto_1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium和Alternaria等細(xì)菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。胡小霞等[5]用HTS技術(shù)分析醬香型酒醅1輪次發(fā)酵過(guò)程群落分布，結(jié)果表明在門(mén)和屬水平上，堆積發(fā)酵檢出的總細(xì)菌、主要細(xì)菌和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)均比窖池發(fā)酵同比數(shù)據(jù)多，堆積發(fā)酵過(guò)程優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有Lactobacillus等13個(gè)，其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主導(dǎo)地位。黃蘊(yùn)利等[11]使用HTS技術(shù)針對(duì)醬香型酒醅第2輪次發(fā)酵過(guò)程微生物演替分布作分析，發(fā)現(xiàn)堆積酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Enterobacteriaceae、Alkaliphilus、Oceanobacillus、Thermoactinomyces10 種。此外，眾多同類(lèi)型研究也對(duì)醬香型酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)作了詳細(xì)描述，在此不一一列舉。
在HTS技術(shù)成本廉價(jià)的近幾年，針對(duì)白酒釀造過(guò)程微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究如雨后春筍般盛行，其成果也加速了對(duì)白酒釀造微生物在群落水平的認(rèn)識(shí)。研究焦點(diǎn)基本落于優(yōu)勢(shì)菌群（abundant taxa，AT），即通常單樣本中相對(duì)豐度≥1%或所有樣本中平均相對(duì)豐度≥0.5%的可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）組成的微生物子群。而在巨大的HTS數(shù)據(jù)集中，數(shù)量占比超過(guò)總OTU數(shù)50%、總相對(duì)豐度通常低于10%的稀有菌群（rare taxa，RT）往往被忽視。RT因豐度極低、數(shù)量巨多，也被定義為OTU秩-豐度曲線中的“長(zhǎng)尾”菌群[12-13]。RT雖然豐度很低，但它們?nèi)宰鳛橐粋€(gè)巨大的遺傳與功能多樣性儲(chǔ)備庫(kù)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性起潛在調(diào)節(jié)作用[14-15]。隨著近些年對(duì)RT的逐步重視，已有其他領(lǐng)域的相關(guān)研究證明了RT的生態(tài)重要性。如RT比AT有更高代謝活性[16-17]；同時(shí)，RT在功能上不同于AT，進(jìn)而為總?cè)郝洌╳hole taxa，WT）提供特定的代謝通路或補(bǔ)償性功能，促使整個(gè)群落功能更加完善[18]。此外，AT和RT對(duì)環(huán)境的不同響應(yīng)，也導(dǎo)致這兩類(lèi)子群在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性上的功能不同[17,19-20]。綜上，先前研究已在其他微生物環(huán)境領(lǐng)域展現(xiàn)出各類(lèi)子群落對(duì)WT的不同作用和影響，但目前基于此方向針對(duì)發(fā)酵體系的研究仍鮮有報(bào)道。醬香型白酒第1、2輪次的發(fā)酵分別對(duì)應(yīng)生產(chǎn)上的下沙和造沙輪次的發(fā)酵，在這2個(gè)階段需要加入新糧，為原糧發(fā)酵和微生物儲(chǔ)備階段。從第3輪次發(fā)酵開(kāi)始不投入新糧，正式進(jìn)入酒醅發(fā)酵階段[10,21]。此階段產(chǎn)出的2輪次基酒能夠增加基酒中酒體的曲香味，使糟醅中累積更多的微生物代謝產(chǎn)物，有利于基酒香味物質(zhì)的積累，在后期輪次相應(yīng)形成更多的醬香型酒前驅(qū)物質(zhì)，同時(shí)為后期輪次多產(chǎn)醬香奠定基礎(chǔ)。因而第3輪次的發(fā)酵是后續(xù)發(fā)酵輪次的基礎(chǔ)，也是后續(xù)各輪次酒的質(zhì)量保障[11]?；诖耍狙芯恳葬u香型酒醅第3輪發(fā)酵輪次堆積過(guò)程為代表，分析AT和RT的演替及其驅(qū)動(dòng)力，闡釋兩種子群對(duì)WT演替的推動(dòng)作用，以及它們各自維持WT穩(wěn)定性的功能角色。以此為進(jìn)一步理解發(fā)酵體系微生物群落功能及生態(tài)穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)及參考思路。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 樣品
樣品取自貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)一醬香酒廠。堆子上取樣深度及部位如圖1所示，從上到下每個(gè)層面對(duì)應(yīng)的深度a～e選取溫度相同的5個(gè)點(diǎn)取樣，均勻混合后作為對(duì)應(yīng)層面的樣品。如位于頂層選取深度30 cm， 溫度相同的5個(gè)點(diǎn)取樣，均勻混合后作為頂層的樣品，依此獲得頂層至底層的酒醅樣品。按此取樣方法，從丟堆第1天（收堆完成）至第8天（堆積結(jié)束），分別得到第1天（D1，0 h）、第3天（D3，49 h）、第5天（D5，95 h）、第7天（D7，143 h）和第8天（D8，164 h）共25個(gè)酒醅樣品。取樣時(shí)車(chē)間溫度9～14 ℃，相對(duì)濕度55%～65%。
圖1 堆子不同部位取樣示意圖Fig. 1 Sample collection from different positions in the stack
1.1.2 試劑
DNA提取試劑盒MP FastDNA?SPIN kit for soil美國(guó)MP Biochemicals公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、TBE（Tris-硼酸-EDTA）緩沖液、異丙醇（分析純）、瓊脂糖 北京索萊寶科技有限公司；引物合成 杭州聯(lián)川生物科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Gene Amp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái) 杭州聯(lián)川生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品預(yù)處理及DNA提取
參照戴奕杰等[8]方法對(duì)酒醅樣品進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后得到的細(xì)胞沉淀，使用DNA提取試劑盒MP FastDNA?SPIN kit for soil，按說(shuō)明書(shū)提示，提取酒醅樣品中微生物細(xì)胞總DNA。
1.3.2 細(xì)菌16S r RNA基因擴(kuò)增
使用引物319F（5’-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’）[22]對(duì)細(xì)菌16S r RNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s，35個(gè)循環(huán)（98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃終延伸10 min。凝膠電泳：2%瓊脂糖凝膠，核酸染料（GenGreen），電壓90 V，電泳時(shí)間30 min。
1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序
采用Illumina HTS技術(shù)，基于Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái)，由杭州聯(lián)川生物科技有限公司完成測(cè)序。
1.3.4 酒醅內(nèi)源性理化指標(biāo)檢測(cè)
微生物在堆積過(guò)程經(jīng)生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生的生物熱會(huì)積累在堆積酒醅當(dāng)中，并作為內(nèi)源因素影響微生物生長(zhǎng)，堆子內(nèi)的水分也是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素，因此堆子的水分含量和溫度常作為酒醅發(fā)酵的重要表征參數(shù)。堆子內(nèi)部有大量酵母菌，氧氣不足時(shí)會(huì)產(chǎn)生乙醇，從而影響其他微生物生長(zhǎng)[23]，因此乙醇也是堆積過(guò)程的重要內(nèi)源指標(biāo)。乳酸和乙酸是白酒中重要的有機(jī)酸，同時(shí)也直接反映酒醅在發(fā)酵過(guò)程中是否正常。特別是乳酸，它是最主要調(diào)節(jié)醬香型白酒酒醅中pH值環(huán)境的物質(zhì)，乳酸的積累與酒醅pH值環(huán)境密切相關(guān)，直接影響微生物群落的演變和發(fā)酵進(jìn)程。另外，乳酸又是不同類(lèi)型白酒中總酸的主要組成部分，最高含量可達(dá)90%以上。因此，醬酒生產(chǎn)中當(dāng)需要探索酸環(huán)境與微生物之間影響關(guān)系時(shí)，通常乳酸最具表征性且作為主要內(nèi)源指標(biāo)[24-26]。綜上所述，本研究選取溫度、乙酸、乙醇、乳酸和水分5 種表征酒醅理化狀況內(nèi)源性指標(biāo)。溫度在取樣時(shí)使用手持式溫度計(jì)測(cè)量并記錄。水分含量使用差重法，稱取10 g新鮮酒醅樣品于135 ℃烘干1 h后稱質(zhì)量，并計(jì)算水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。參考Song Zhewei等[27]方法使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定乙酸和乙醇含量。參考Bai Dongmei等[28]方法使用反相高效液相色譜測(cè)定乳酸含量。
1.3.5 高通量數(shù)據(jù)處理
PE300雙端測(cè)序reads使用FLASH拼接，根據(jù)Barcode區(qū)分序列樣本來(lái)源，使用QIIME分析管道[24]完成去偶聯(lián)、質(zhì)控、解析等過(guò)程。原始reads中含有超過(guò)3個(gè)連續(xù)堿基、質(zhì)量評(píng)分小于Q20等級(jí)以及在同源匹配區(qū)域大于6個(gè)模糊堿基的序列一律被過(guò)濾掉；此外，使用USEARCH識(shí)別并除去嵌合體序列，以此獲得可供分析的高質(zhì)量有效序列[29]。使用UCLUST在97%序列相似度水平獲得OTU[30]，并從每個(gè)OTU中選取質(zhì)量最好的序列作為對(duì)應(yīng)OTU的代表序列。每個(gè)OTU代表序列利用RDP Classifier生成對(duì)應(yīng)OTU的系統(tǒng)分類(lèi)信息[31-32]。生成的OTU_table文件除去總序列數(shù)小于5的低豐度OTU，并利用R軟件對(duì)OTU序列數(shù)進(jìn)行重抽樣，保證每個(gè)樣品的總序列數(shù)完全一致，最終獲得用于統(tǒng)計(jì)分析OTU_table文件。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析
所有分析使用R軟件各類(lèi)程序包完成。
參照已有研究[19,33-34]，并結(jié)合本研究數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，按以下方式將WT即所有OTU分成3個(gè)子群。AT：在所有樣品中平均相對(duì)豐度≥0.05%，并且至少在1個(gè)樣品中相對(duì)豐度≥1%。RT：在所有樣品中平均相對(duì)豐度＜0.001%，并且在任一樣品中相對(duì)豐度＜0.1%。條件稀有菌群（conditionally rare taxa，CRT）：根據(jù)Shade等[35]報(bào)道，在群落中通常豐度很低，屬于RT的一種，但在特定條件下豐度會(huì)瞬間變高，這一類(lèi)RT稱為CRT。本研究以每個(gè)OTU在D1～D9各時(shí)段平均相對(duì)豐度為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，利用Shade等[35]雙峰分布模型，計(jì)算每個(gè)OTU的雙峰狀態(tài)系數(shù)b，即：
式中：xi為第i個(gè)OTU的相對(duì)豐度；為第i個(gè)OTU平均相對(duì)豐度。
凡雙峰狀態(tài)系數(shù)b＞0.9、最高相對(duì)豐度＞0.1%的OTU可被認(rèn)定為CRT。
α多樣性使用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)衡量，β多樣性使用Bray-Curtis非相似度矩陣衡量。群落演替分別使用物種-時(shí)間關(guān)系（species-time relationship，STR）模型[36-37]和時(shí)間-衰減關(guān)系模型（time-decay relationship，TDR）[33]衡量。參考White等[38]移窗法將時(shí)間分成多個(gè)區(qū)間，基于物種豐富度在不同時(shí)間區(qū)間的積累變化量，擬合STR模型[36-37]，即S＝k×Tz，其中S為物種豐富度Chao1指數(shù)，k為估計(jì)參數(shù)，T為時(shí)間間隔，z為物種積累變化率。TDR基于最小二乘線性回歸Ss = constant-w×T，估計(jì)群落相似度隨時(shí)間推移的變化趨勢(shì)[39]。其中Ss為群落相似度（1-Bray-Curtis非相似度），T為時(shí)間跨度，constant為模型估計(jì)參數(shù)，w為群落相似度隨時(shí)間推移的變化速率，即群落結(jié)構(gòu)演替速率。
相似度檢驗(yàn)和非參數(shù)多元方差分析檢驗(yàn)樣本分組間（時(shí)間段間）群落結(jié)構(gòu)差異性；Mantel檢驗(yàn)分析子群落的群落結(jié)構(gòu)差異對(duì)WT（基于所有OTU）的群落結(jié)構(gòu)差異的影響；使用限制對(duì)應(yīng)分析（constrained correspondence analysis，CCA）檢驗(yàn)影響各子群落演替的內(nèi)源理化因子?；赟pearman相關(guān)性，分析微生物間共存網(wǎng)絡(luò)。Spearman相關(guān)性系數(shù)r≥0.6，顯著性P值經(jīng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）矯正后的顯著性值q小于0.05的OTU用于構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并使用Gephi軟件呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖[40]。分別在節(jié)點(diǎn)水平和子網(wǎng)絡(luò)水平計(jì)算各子群在網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)湎禂?shù)[41-42]。
2 結(jié)果與分析
2.1 α多樣性及群落結(jié)構(gòu)分布
原始序列經(jīng)質(zhì)控、OTU聚類(lèi)和樣本reads數(shù)均一化處理，共得到493 050 條reads，6 943個(gè)OTU，每個(gè)樣本包含19 722 條reads。將這些OTU按AT、RT和CRT分成3個(gè)子群，每個(gè)子群及WT的α多樣性信息如表1所示，AT豐度占比為84.1%，RT為1.8%，CRT為12.0%；AT的OTU數(shù)量占比為0.4%，RT為70.9%，CRT為0.1%。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示RT多樣性顯著高于其他子群及WT；Pielous指數(shù)顯示RT均勻度也顯著高于其他子群及WT。這個(gè)結(jié)果表明，RT可能是維持發(fā)酵系統(tǒng)群落穩(wěn)定的重要保障。因?yàn)樵谏鷳B(tài)系統(tǒng)中，微生物體系的多樣性是維持生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定性的重要條件[43-45]。
表1 細(xì)菌WT和各子群α多樣性信息Table 1 Information about alpha diversity in whole bacterial community and each sub-community
圖2 發(fā)酵過(guò)程各子群在門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 2 Alluvial diagram showing the distribution of sub-community composition at the phylum level during stacking fermentation
圖3 AT、RT和CRT豐度時(shí)空分布圖Fig. 3 Temporal and spatial distribution of mean abundances of the three sub-communties
3個(gè)子群在門(mén)水平的分布顯示（圖2），AT僅由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）組成；RT主要由厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）組成；CRT僅由厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)組成。屬水平，AT由芽孢桿菌屬（Bacillus）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、火山渣芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、Kroppenstedtia、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、片球菌屬（Pediococcus）和甲基桿菌屬（Methylobacterium）組成。RT除了包含上述各屬外（不含片球菌屬），還主要由假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、梭狀桿菌屬（Clostridium）、乳酸乳球菌屬（Lactococcus）、異常球菌屬（Deinococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）組成。CRT由嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和腸球菌屬（Enterococcus）組成。這些微生物雖然在先前研究中有所報(bào)道，但本研究闡明了這些微生物具體的子群落歸屬，對(duì)深入理解發(fā)酵過(guò)程微生物區(qū)系的群落結(jié)構(gòu)提供分析依據(jù)。此外，從3 類(lèi)子群在時(shí)空上的平均豐度（平均reads數(shù)）變化趨勢(shì)可以看出（圖3），AT和CRT較為相似。時(shí)間尺度上，AT和CRT平均豐度在D1時(shí)最低，分別為528和195；D3～D7相對(duì)較高，AT平均豐度為696～678，CRT平均豐度為277～288；至D8時(shí)有所回落，AT和CRT平均豐度分別為630和240?？臻g尺度上，AT和CRT在堆子上層（AT：596；CRT：236）和下層（AT：599；CRT：210）平均豐度相對(duì)較高，而在頂層（AT：528；CRT：195）、中層（AT：581；CRT：186）和底層（AT：522；CRT：188）相對(duì)較低。RT平均豐度的變化趨勢(shì)與AT和CRT相比略有差異。時(shí)間尺度上，RT在D1～D7呈下降趨勢(shì)（0.17～0.05），至D8（0.09）稍有回升?？臻g尺度上，RT在下層（0.19）和底層（0.19）相對(duì)豐度較高，其次為頂層（0.17）和中層（0.16），上層（0.14）最低。這些結(jié)果初步表明，RT與AT和CRT相比，具有相對(duì)獨(dú)立的演替模式。
2.2 β多樣性分析
Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，WTβ多樣性分別與AT、RT和CRT的β多樣性顯著相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明3個(gè)子群落的結(jié)構(gòu)演替對(duì)WT的結(jié)構(gòu)演替都有貢獻(xiàn)。從相關(guān)性系數(shù)r看，AT最高（r=0.985），其次是CRT（r=0.908）和RT（r=0.793），表明AT是WT結(jié)構(gòu)演替的主體，代表WT演替的方向和趨勢(shì)，CRT對(duì)WT演替起到一定推動(dòng)作用，RT與AT和CRT相比，在WT中的演替相對(duì)獨(dú)立。此外，3個(gè)子群落在WT中β多樣性占比也可看出，AT是推動(dòng)WT演替的主體群落，占比31.5%；其次是CRT，占比4.5%；RT對(duì)WT演替影響最小，占比1.8%。WT和3個(gè)子群分別擬合STR模型發(fā)現(xiàn)，僅WT和RT存在極顯著z值（P＜0.001），分別為-0.48和-0.68，其他兩個(gè)子群的z值無(wú)顯著性（AT：z=0.005；CRT：z=0.02；P＞0.05）。說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中WT的物種積累數(shù)以0.48的速率呈指數(shù)趨勢(shì)縮減，且來(lái)自于RT的快速縮減。此外，WT和3個(gè)子群擬合TDR均可得到極顯著的負(fù)斜率（P＜0.001，圖4），即隨發(fā)酵時(shí)間的推移，酒醅內(nèi)群落結(jié)構(gòu)會(huì)以恒定的速率發(fā)生演替。3個(gè)子群落中，CRT陡度最高（|w|=0.047），演替速率最快，AT（|w|=0.034）次之，RT演替速率最慢（|w|=0.008）。結(jié)合WT演替速率（|w|=0.037），可以看出，CRT和AT是決定WT演替速率的主要菌群。Carvalho等[46]認(rèn)為群落β多樣性，即群落結(jié)構(gòu)演替變化由物種豐富度和物種豐度兩方面因素決定。使用STR和TDR兩種模型可分別從物種豐富度和物種豐度2個(gè)角度探究微生物群落在發(fā)酵過(guò)程中如何演替以及演替的內(nèi)驅(qū)菌群，并且對(duì)微生物演替的速度作定量描述。先前關(guān)于釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)演替的研究，主要聚焦于微生物系統(tǒng)分類(lèi)群如何隨時(shí)間或空間的變化而發(fā)生改變。本研究從群落演替的動(dòng)力角度入手，為深入剖析發(fā)酵過(guò)程群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，并通過(guò)演替速率間接認(rèn)識(shí)發(fā)酵動(dòng)力提供理論參考。
圖4 群落相似度與時(shí)間跨度關(guān)系曲線圖Fig. 4 Curves showing community similarity against time span
2.3 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析
利用Spearman相關(guān)性構(gòu)建共存網(wǎng)絡(luò)（圖5），網(wǎng)絡(luò)內(nèi)共有6 898個(gè)相互間顯著相關(guān)（q＜0.01）節(jié)點(diǎn)（OTU），816 922個(gè)連接邊。其中，AT節(jié)點(diǎn)24個(gè)，CRT節(jié)點(diǎn)4個(gè)，RT節(jié)點(diǎn)4 914個(gè)，其他節(jié)點(diǎn)1 956個(gè)。分別對(duì)AT、CRT、RT以及不屬于這3種子群類(lèi)型的其他子群（others）計(jì)算節(jié)點(diǎn)水平網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湎禂?shù)（表2），可以看出RT中介中心度、接近中心度和平均連接度均高于其他子群，且接近中心度和平均連接度顯著高于其他子群。此外，RT的平均最短路徑長(zhǎng)度也顯著短于其他子群。此結(jié)果表明RT相比其他子群更加處于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的中心位置，從而起到維持整個(gè)發(fā)酵微生態(tài)體系穩(wěn)定性的作用[19-20]。基于這一點(diǎn)，進(jìn)一步體現(xiàn)出RT高多樣性帶來(lái)的群落生態(tài)穩(wěn)定性特點(diǎn)。從平均聚類(lèi)系數(shù)上看，CRT稍高于AT，并且這兩個(gè)子群的平均聚類(lèi)系數(shù)明顯高于其他子群，顯著高于RT，表明CRT和AT中的細(xì)菌在各自子群內(nèi)相比其他子群中的細(xì)菌關(guān)聯(lián)程度更加緊密，具有更強(qiáng)的共存和相互協(xié)作性。此外，通過(guò)計(jì)算各子群在網(wǎng)絡(luò)水平的拓?fù)湎禂?shù)，可以看出AT和CRT的平均路徑長(zhǎng)度和網(wǎng)絡(luò)直徑明顯低于其他子群，而網(wǎng)絡(luò)密度明顯高于其他子群，進(jìn)一步說(shuō)明CRT和AT內(nèi)的微生物相互作用和聯(lián)系更加緊密。此外，從模塊化程度看，AT最高，表明AT與其他子群相比，區(qū)系化更強(qiáng)。
圖5 子群落間共存網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig. 5 Network showing co-occurrence patterns among sub-communities
表2 各子群在共存網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)湎禂?shù)Table 2 Topological coefficients of three sub-communities in co-occurrence network
2.4 群落演替與內(nèi)源理化因子間關(guān)系
酒醅內(nèi)源性理化因子，如乙醇、水分、乳酸、乙酸含量以及溫度都會(huì)因發(fā)酵過(guò)程微生物代謝方式或活性的改變而發(fā)生改變，進(jìn)而影響微生物群落的組成。為進(jìn)一步理解各子群的演替與內(nèi)源理化因子間關(guān)系，上述5個(gè)理化因子（表3）分別與各子群OTU相對(duì)豐度進(jìn)行CCA（圖6）。結(jié)果顯示，酒醅內(nèi)水分含量與AT演替顯著相關(guān)（P＜0.05，R2=0.09），AT由D1向D7的演替變化與水分含量呈正相關(guān)，隨后從D7向D8的演替與水分含量呈負(fù)相關(guān)，表明AT與酒醅水分含量關(guān)系密切。乙酸與RT演替顯著相關(guān)（P＜0.05，R2=0.05），且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程D1～D8，乙酸含量與RT呈負(fù)相關(guān)，表明RT的改變可能對(duì)乙酸含量影響較大。乙醇和乳酸含量與CRT演替顯著相關(guān)（P＜0.01，R2=0.52），且CRT從D1到D7的演替與溫度、乙醇和乳酸含量呈正相關(guān)，從D7到D8的演替與溫度呈正相關(guān)，與乙醇和乳酸含量呈負(fù)相關(guān)。此外，CRT的CCA模型R2至少是AT和RT的CCA模型R2的5 倍，表明CRT微生物對(duì)內(nèi)源環(huán)境因子的敏感性遠(yuǎn)高于其他微生物，因此發(fā)酵環(huán)境的改變最易影響CRT微生物的組成結(jié)構(gòu)，CRT的改變?cè)賹?duì)整個(gè)群落產(chǎn)生影響。對(duì)廢水、有機(jī)物、飲用水、農(nóng)林和土壤等微生態(tài)環(huán)境的微生物群落研究曾發(fā)現(xiàn)[19,20,35,47-48]，CRT環(huán)境中如同微生物種子庫(kù)，其種群密度會(huì)因環(huán)境條件的改變迅速擴(kuò)大或消耗殆盡，可作為關(guān)鍵微生物調(diào)節(jié)整個(gè)群落結(jié)構(gòu)，維持微生物間生態(tài)穩(wěn)定性；同時(shí)，某些CRT微生物可作為環(huán)境改變的信號(hào)，指示具體影響微生物動(dòng)態(tài)變化的物理、化學(xué)以及生物驅(qū)動(dòng)力。在本研究基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步探索CRT微生物，為調(diào)節(jié)、合理優(yōu)化發(fā)酵體系中微生物結(jié)構(gòu)另辟蹊徑。
表3 堆積發(fā)酵不同時(shí)段酒醅內(nèi)源理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical parameters of fermented grains at different stacking fermentation periods
圖6 各子群演替模式與內(nèi)源理化因子間CCA排序圖Fig. 6 CCA ordination describing the relationships between physicochemical factors and succession patterns of three sub-communities
3 結(jié) 論
本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合一定的數(shù)理統(tǒng)計(jì)手段，系統(tǒng)闡釋了AT、RT和CRT三類(lèi)細(xì)菌群在酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程中對(duì)WT演替的作用和影響，并得出相關(guān)結(jié)論：AT和CRT具有相似的演替模式，且AT決定WT的演替趨勢(shì)和方向，CRT對(duì)WT的演替起到一定推動(dòng)作用；WT演替速率主要由AT和CRT決定，WT物種積累數(shù)的縮減主要來(lái)自于RT的快速縮減；RT在WT中的演替相對(duì)獨(dú)立，并且是維持發(fā)酵過(guò)程微生態(tài)體系穩(wěn)定性的重要菌群，體系中環(huán)境的改變最易影響CRT組成結(jié)構(gòu)，致使CRT對(duì)總?cè)郝浣Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。
猜你喜歡
超聚焦子群是16階初等交換群的塊數(shù)學(xué)年刊A輯(中文版)(2022年1期)2022-08-20 08:50:50 大學(xué)生牙齦炎齦上菌斑的微生物群落昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2022年2期)2022-03-29 00:51:58 合成微生物群落在發(fā)酵食品中的應(yīng)用研究食品安全導(dǎo)刊(2021年20期)2021-08-30 06:40:50 子群的核平凡或正規(guī)閉包極大的有限p群數(shù)學(xué)年刊A輯(中文版)(2021年4期)2021-02-12 01:21:00 微生物技術(shù)在醬香型白酒生產(chǎn)中應(yīng)用食品安全導(dǎo)刊(2016年36期)2016-03-28 05:50:49 電子舌在不同輪次醬香型白酒區(qū)分識(shí)別中的應(yīng)用中國(guó)釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:23 茅臺(tái)醬香型酒糟和酒曲脂溶性成分及抗菌活性研究中國(guó)釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:10 醬香型白酒理化指標(biāo)的Logistic模型湖北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)(2015年1期)2016-01-10 08:41:12 恰有11個(gè)極大子群的有限冪零群哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)(2015年1期)2015-04-19 06:55:30 春季和夏季巢湖浮游生物群落組成及其動(dòng)態(tài)分析水生生物學(xué)報(bào)(2015年1期)2015-02-28 16:01:05
趙 亮，閔 卓，吳福勇，江 璐，李芳香，鐘艷霞，張 陽(yáng)，莫新良，何 惠，王新葉
（茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州 遵義 564507）
堆積發(fā)酵是醬香白酒釀造的獨(dú)特關(guān)鍵工序，屬于邊糖化、邊發(fā)酵方式。高溫大曲的曲藥微生物能在酒醅上增殖、發(fā)酵，同時(shí)高溫堆積網(wǎng)羅、富集環(huán)境空氣中的微生物，生成醬香或醬香前體物質(zhì)，為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件，相當(dāng)于“二次制曲”[1-5]，也為入窖發(fā)酵提供糖化基礎(chǔ)和微生物儲(chǔ)備[6-7]。
醬香型白酒中最重要且研究最多的微生物類(lèi)群是細(xì)菌，其主要來(lái)自于高溫制曲和堆積工序。細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物在高溫操作過(guò)程中強(qiáng)化了糟醅自身形成醬香的原動(dòng)力，促進(jìn)醬香物質(zhì)的進(jìn)一步生成[8]。因此，堆積發(fā)酵的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其變化對(duì)后期窖內(nèi)產(chǎn)酒和生香具有舉足輕重的作用，而研究醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)是解析發(fā)酵機(jī)理和風(fēng)味形成的基礎(chǔ)保障[5]，在近幾年引起眾多學(xué)者的關(guān)注。程才瓔等[9]使用變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析了醬香型白酒7個(gè)輪次細(xì)菌分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)同一輪次堆積發(fā)酵的前期、后期和中期多樣性依此增大，Bacillus、Thermoactinomycetaceae、Staphylococcus、Virgibacillus、Lactobacillus、Corynebacterium、Streptomyces、Lentibacillus及一些不可培養(yǎng)類(lèi)群為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群。Wang Li等[10]使用高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Bacillaceae和Lactobacillales分別為堆積前期和窖內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群，并且多數(shù)來(lái)自大曲的細(xì)菌對(duì)堆積發(fā)酵前期的群落結(jié)構(gòu)形成有重要作用。戴奕杰等[8]使用HTS技術(shù)分析醬香型酒醅整個(gè)生產(chǎn)周期所有輪次細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在產(chǎn)酒發(fā)酵階段Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium_sensu_stricto_1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium和Alternaria等細(xì)菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。胡小霞等[5]用HTS技術(shù)分析醬香型酒醅1輪次發(fā)酵過(guò)程群落分布，結(jié)果表明在門(mén)和屬水平上，堆積發(fā)酵檢出的總細(xì)菌、主要細(xì)菌和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)均比窖池發(fā)酵同比數(shù)據(jù)多，堆積發(fā)酵過(guò)程優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有Lactobacillus等13個(gè)，其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主導(dǎo)地位。黃蘊(yùn)利等[11]使用HTS技術(shù)針對(duì)醬香型酒醅第2輪次發(fā)酵過(guò)程微生物演替分布作分析，發(fā)現(xiàn)堆積酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Enterobacteriaceae、Alkaliphilus、Oceanobacillus、Thermoactinomyces10 種。此外，眾多同類(lèi)型研究也對(duì)醬香型酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)作了詳細(xì)描述，在此不一一列舉。
在HTS技術(shù)成本廉價(jià)的近幾年，針對(duì)白酒釀造過(guò)程微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究如雨后春筍般盛行，其成果也加速了對(duì)白酒釀造微生物在群落水平的認(rèn)識(shí)。研究焦點(diǎn)基本落于優(yōu)勢(shì)菌群（abundant taxa，AT），即通常單樣本中相對(duì)豐度≥1%或所有樣本中平均相對(duì)豐度≥0.5%的可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）組成的微生物子群。而在巨大的HTS數(shù)據(jù)集中，數(shù)量占比超過(guò)總OTU數(shù)50%、總相對(duì)豐度通常低于10%的稀有菌群（rare taxa，RT）往往被忽視。RT因豐度極低、數(shù)量巨多，也被定義為OTU秩-豐度曲線中的“長(zhǎng)尾”菌群[12-13]。RT雖然豐度很低，但它們?nèi)宰鳛橐粋€(gè)巨大的遺傳與功能多樣性儲(chǔ)備庫(kù)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性起潛在調(diào)節(jié)作用[14-15]。隨著近些年對(duì)RT的逐步重視，已有其他領(lǐng)域的相關(guān)研究證明了RT的生態(tài)重要性。如RT比AT有更高代謝活性[16-17]；同時(shí)，RT在功能上不同于AT，進(jìn)而為總?cè)郝洌╳hole taxa，WT）提供特定的代謝通路或補(bǔ)償性功能，促使整個(gè)群落功能更加完善[18]。此外，AT和RT對(duì)環(huán)境的不同響應(yīng)，也導(dǎo)致這兩類(lèi)子群在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性上的功能不同[17,19-20]。綜上，先前研究已在其他微生物環(huán)境領(lǐng)域展現(xiàn)出各類(lèi)子群落對(duì)WT的不同作用和影響，但目前基于此方向針對(duì)發(fā)酵體系的研究仍鮮有報(bào)道。醬香型白酒第1、2輪次的發(fā)酵分別對(duì)應(yīng)生產(chǎn)上的下沙和造沙輪次的發(fā)酵，在這2個(gè)階段需要加入新糧，為原糧發(fā)酵和微生物儲(chǔ)備階段。從第3輪次發(fā)酵開(kāi)始不投入新糧，正式進(jìn)入酒醅發(fā)酵階段[10,21]。此階段產(chǎn)出的2輪次基酒能夠增加基酒中酒體的曲香味，使糟醅中累積更多的微生物代謝產(chǎn)物，有利于基酒香味物質(zhì)的積累，在后期輪次相應(yīng)形成更多的醬香型酒前驅(qū)物質(zhì)，同時(shí)為后期輪次多產(chǎn)醬香奠定基礎(chǔ)。因而第3輪次的發(fā)酵是后續(xù)發(fā)酵輪次的基礎(chǔ)，也是后續(xù)各輪次酒的質(zhì)量保障[11]?；诖耍狙芯恳葬u香型酒醅第3輪發(fā)酵輪次堆積過(guò)程為代表，分析AT和RT的演替及其驅(qū)動(dòng)力，闡釋兩種子群對(duì)WT演替的推動(dòng)作用，以及它們各自維持WT穩(wěn)定性的功能角色。以此為進(jìn)一步理解發(fā)酵體系微生物群落功能及生態(tài)穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)及參考思路。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 樣品
樣品取自貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)一醬香酒廠。堆子上取樣深度及部位如圖1所示，從上到下每個(gè)層面對(duì)應(yīng)的深度a～e選取溫度相同的5個(gè)點(diǎn)取樣，均勻混合后作為對(duì)應(yīng)層面的樣品。如位于頂層選取深度30 cm， 溫度相同的5個(gè)點(diǎn)取樣，均勻混合后作為頂層的樣品，依此獲得頂層至底層的酒醅樣品。按此取樣方法，從丟堆第1天（收堆完成）至第8天（堆積結(jié)束），分別得到第1天（D1，0 h）、第3天（D3，49 h）、第5天（D5，95 h）、第7天（D7，143 h）和第8天（D8，164 h）共25個(gè)酒醅樣品。取樣時(shí)車(chē)間溫度9～14 ℃，相對(duì)濕度55%～65%。
圖1 堆子不同部位取樣示意圖Fig. 1 Sample collection from different positions in the stack
1.1.2 試劑
DNA提取試劑盒MP FastDNA?SPIN kit for soil美國(guó)MP Biochemicals公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、TBE（Tris-硼酸-EDTA）緩沖液、異丙醇（分析純）、瓊脂糖 北京索萊寶科技有限公司；引物合成 杭州聯(lián)川生物科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Gene Amp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái) 杭州聯(lián)川生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品預(yù)處理及DNA提取
參照戴奕杰等[8]方法對(duì)酒醅樣品進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后得到的細(xì)胞沉淀，使用DNA提取試劑盒MP FastDNA?SPIN kit for soil，按說(shuō)明書(shū)提示，提取酒醅樣品中微生物細(xì)胞總DNA。
1.3.2 細(xì)菌16S r RNA基因擴(kuò)增
使用引物319F（5’-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’）[22]對(duì)細(xì)菌16S r RNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s，35個(gè)循環(huán)（98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃終延伸10 min。凝膠電泳：2%瓊脂糖凝膠，核酸染料（GenGreen），電壓90 V，電泳時(shí)間30 min。
1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序
采用Illumina HTS技術(shù)，基于Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái)，由杭州聯(lián)川生物科技有限公司完成測(cè)序。
1.3.4 酒醅內(nèi)源性理化指標(biāo)檢測(cè)
微生物在堆積過(guò)程經(jīng)生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生的生物熱會(huì)積累在堆積酒醅當(dāng)中，并作為內(nèi)源因素影響微生物生長(zhǎng)，堆子內(nèi)的水分也是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素，因此堆子的水分含量和溫度常作為酒醅發(fā)酵的重要表征參數(shù)。堆子內(nèi)部有大量酵母菌，氧氣不足時(shí)會(huì)產(chǎn)生乙醇，從而影響其他微生物生長(zhǎng)[23]，因此乙醇也是堆積過(guò)程的重要內(nèi)源指標(biāo)。乳酸和乙酸是白酒中重要的有機(jī)酸，同時(shí)也直接反映酒醅在發(fā)酵過(guò)程中是否正常。特別是乳酸，它是最主要調(diào)節(jié)醬香型白酒酒醅中pH值環(huán)境的物質(zhì)，乳酸的積累與酒醅pH值環(huán)境密切相關(guān)，直接影響微生物群落的演變和發(fā)酵進(jìn)程。另外，乳酸又是不同類(lèi)型白酒中總酸的主要組成部分，最高含量可達(dá)90%以上。因此，醬酒生產(chǎn)中當(dāng)需要探索酸環(huán)境與微生物之間影響關(guān)系時(shí)，通常乳酸最具表征性且作為主要內(nèi)源指標(biāo)[24-26]。綜上所述，本研究選取溫度、乙酸、乙醇、乳酸和水分5 種表征酒醅理化狀況內(nèi)源性指標(biāo)。溫度在取樣時(shí)使用手持式溫度計(jì)測(cè)量并記錄。水分含量使用差重法，稱取10 g新鮮酒醅樣品于135 ℃烘干1 h后稱質(zhì)量，并計(jì)算水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。參考Song Zhewei等[27]方法使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定乙酸和乙醇含量。參考Bai Dongmei等[28]方法使用反相高效液相色譜測(cè)定乳酸含量。
1.3.5 高通量數(shù)據(jù)處理
PE300雙端測(cè)序reads使用FLASH拼接，根據(jù)Barcode區(qū)分序列樣本來(lái)源，使用QIIME分析管道[24]完成去偶聯(lián)、質(zhì)控、解析等過(guò)程。原始reads中含有超過(guò)3個(gè)連續(xù)堿基、質(zhì)量評(píng)分小于Q20等級(jí)以及在同源匹配區(qū)域大于6個(gè)模糊堿基的序列一律被過(guò)濾掉；此外，使用USEARCH識(shí)別并除去嵌合體序列，以此獲得可供分析的高質(zhì)量有效序列[29]。使用UCLUST在97%序列相似度水平獲得OTU[30]，并從每個(gè)OTU中選取質(zhì)量最好的序列作為對(duì)應(yīng)OTU的代表序列。每個(gè)OTU代表序列利用RDP Classifier生成對(duì)應(yīng)OTU的系統(tǒng)分類(lèi)信息[31-32]。生成的OTU_table文件除去總序列數(shù)小于5的低豐度OTU，并利用R軟件對(duì)OTU序列數(shù)進(jìn)行重抽樣，保證每個(gè)樣品的總序列數(shù)完全一致，最終獲得用于統(tǒng)計(jì)分析OTU_table文件。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析
所有分析使用R軟件各類(lèi)程序包完成。
參照已有研究[19,33-34]，并結(jié)合本研究數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，按以下方式將WT即所有OTU分成3個(gè)子群。AT：在所有樣品中平均相對(duì)豐度≥0.05%，并且至少在1個(gè)樣品中相對(duì)豐度≥1%。RT：在所有樣品中平均相對(duì)豐度＜0.001%，并且在任一樣品中相對(duì)豐度＜0.1%。條件稀有菌群（conditionally rare taxa，CRT）：根據(jù)Shade等[35]報(bào)道，在群落中通常豐度很低，屬于RT的一種，但在特定條件下豐度會(huì)瞬間變高，這一類(lèi)RT稱為CRT。本研究以每個(gè)OTU在D1～D9各時(shí)段平均相對(duì)豐度為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，利用Shade等[35]雙峰分布模型，計(jì)算每個(gè)OTU的雙峰狀態(tài)系數(shù)b，即：
式中：xi為第i個(gè)OTU的相對(duì)豐度；為第i個(gè)OTU平均相對(duì)豐度。
凡雙峰狀態(tài)系數(shù)b＞0.9、最高相對(duì)豐度＞0.1%的OTU可被認(rèn)定為CRT。
α多樣性使用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)衡量，β多樣性使用Bray-Curtis非相似度矩陣衡量。群落演替分別使用物種-時(shí)間關(guān)系（species-time relationship，STR）模型[36-37]和時(shí)間-衰減關(guān)系模型（time-decay relationship，TDR）[33]衡量。參考White等[38]移窗法將時(shí)間分成多個(gè)區(qū)間，基于物種豐富度在不同時(shí)間區(qū)間的積累變化量，擬合STR模型[36-37]，即S＝k×Tz，其中S為物種豐富度Chao1指數(shù)，k為估計(jì)參數(shù)，T為時(shí)間間隔，z為物種積累變化率。TDR基于最小二乘線性回歸Ss = constant-w×T，估計(jì)群落相似度隨時(shí)間推移的變化趨勢(shì)[39]。其中Ss為群落相似度（1-Bray-Curtis非相似度），T為時(shí)間跨度，constant為模型估計(jì)參數(shù)，w為群落相似度隨時(shí)間推移的變化速率，即群落結(jié)構(gòu)演替速率。
相似度檢驗(yàn)和非參數(shù)多元方差分析檢驗(yàn)樣本分組間（時(shí)間段間）群落結(jié)構(gòu)差異性；Mantel檢驗(yàn)分析子群落的群落結(jié)構(gòu)差異對(duì)WT（基于所有OTU）的群落結(jié)構(gòu)差異的影響；使用限制對(duì)應(yīng)分析（constrained correspondence analysis，CCA）檢驗(yàn)影響各子群落演替的內(nèi)源理化因子?；赟pearman相關(guān)性，分析微生物間共存網(wǎng)絡(luò)。Spearman相關(guān)性系數(shù)r≥0.6，顯著性P值經(jīng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）矯正后的顯著性值q小于0.05的OTU用于構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并使用Gephi軟件呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖[40]。分別在節(jié)點(diǎn)水平和子網(wǎng)絡(luò)水平計(jì)算各子群在網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)湎禂?shù)[41-42]。
2 結(jié)果與分析
2.1 α多樣性及群落結(jié)構(gòu)分布
原始序列經(jīng)質(zhì)控、OTU聚類(lèi)和樣本reads數(shù)均一化處理，共得到493 050 條reads，6 943個(gè)OTU，每個(gè)樣本包含19 722 條reads。將這些OTU按AT、RT和CRT分成3個(gè)子群，每個(gè)子群及WT的α多樣性信息如表1所示，AT豐度占比為84.1%，RT為1.8%，CRT為12.0%；AT的OTU數(shù)量占比為0.4%，RT為70.9%，CRT為0.1%。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示RT多樣性顯著高于其他子群及WT；Pielous指數(shù)顯示RT均勻度也顯著高于其他子群及WT。這個(gè)結(jié)果表明，RT可能是維持發(fā)酵系統(tǒng)群落穩(wěn)定的重要保障。因?yàn)樵谏鷳B(tài)系統(tǒng)中，微生物體系的多樣性是維持生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定性的重要條件[43-45]。
表1 細(xì)菌WT和各子群α多樣性信息Table 1 Information about alpha diversity in whole bacterial community and each sub-community
圖2 發(fā)酵過(guò)程各子群在門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 2 Alluvial diagram showing the distribution of sub-community composition at the phylum level during stacking fermentation
圖3 AT、RT和CRT豐度時(shí)空分布圖Fig. 3 Temporal and spatial distribution of mean abundances of the three sub-communties
3個(gè)子群在門(mén)水平的分布顯示（圖2），AT僅由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）組成；RT主要由厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）組成；CRT僅由厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)組成。屬水平，AT由芽孢桿菌屬（Bacillus）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、火山渣芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、Kroppenstedtia、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、片球菌屬（Pediococcus）和甲基桿菌屬（Methylobacterium）組成。RT除了包含上述各屬外（不含片球菌屬），還主要由假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、梭狀桿菌屬（Clostridium）、乳酸乳球菌屬（Lactococcus）、異常球菌屬（Deinococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）組成。CRT由嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和腸球菌屬（Enterococcus）組成。這些微生物雖然在先前研究中有所報(bào)道，但本研究闡明了這些微生物具體的子群落歸屬，對(duì)深入理解發(fā)酵過(guò)程微生物區(qū)系的群落結(jié)構(gòu)提供分析依據(jù)。此外，從3 類(lèi)子群在時(shí)空上的平均豐度（平均reads數(shù)）變化趨勢(shì)可以看出（圖3），AT和CRT較為相似。時(shí)間尺度上，AT和CRT平均豐度在D1時(shí)最低，分別為528和195；D3～D7相對(duì)較高，AT平均豐度為696～678，CRT平均豐度為277～288；至D8時(shí)有所回落，AT和CRT平均豐度分別為630和240?？臻g尺度上，AT和CRT在堆子上層（AT：596；CRT：236）和下層（AT：599；CRT：210）平均豐度相對(duì)較高，而在頂層（AT：528；CRT：195）、中層（AT：581；CRT：186）和底層（AT：522；CRT：188）相對(duì)較低。RT平均豐度的變化趨勢(shì)與AT和CRT相比略有差異。時(shí)間尺度上，RT在D1～D7呈下降趨勢(shì)（0.17～0.05），至D8（0.09）稍有回升?？臻g尺度上，RT在下層（0.19）和底層（0.19）相對(duì)豐度較高，其次為頂層（0.17）和中層（0.16），上層（0.14）最低。這些結(jié)果初步表明，RT與AT和CRT相比，具有相對(duì)獨(dú)立的演替模式。
2.2 β多樣性分析
Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，WTβ多樣性分別與AT、RT和CRT的β多樣性顯著相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明3個(gè)子群落的結(jié)構(gòu)演替對(duì)WT的結(jié)構(gòu)演替都有貢獻(xiàn)。從相關(guān)性系數(shù)r看，AT最高（r=0.985），其次是CRT（r=0.908）和RT（r=0.793），表明AT是WT結(jié)構(gòu)演替的主體，代表WT演替的方向和趨勢(shì)，CRT對(duì)WT演替起到一定推動(dòng)作用，RT與AT和CRT相比，在WT中的演替相對(duì)獨(dú)立。此外，3個(gè)子群落在WT中β多樣性占比也可看出，AT是推動(dòng)WT演替的主體群落，占比31.5%；其次是CRT，占比4.5%；RT對(duì)WT演替影響最小，占比1.8%。WT和3個(gè)子群分別擬合STR模型發(fā)現(xiàn)，僅WT和RT存在極顯著z值（P＜0.001），分別為-0.48和-0.68，其他兩個(gè)子群的z值無(wú)顯著性（AT：z=0.005；CRT：z=0.02；P＞0.05）。說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中WT的物種積累數(shù)以0.48的速率呈指數(shù)趨勢(shì)縮減，且來(lái)自于RT的快速縮減。此外，WT和3個(gè)子群擬合TDR均可得到極顯著的負(fù)斜率（P＜0.001，圖4），即隨發(fā)酵時(shí)間的推移，酒醅內(nèi)群落結(jié)構(gòu)會(huì)以恒定的速率發(fā)生演替。3個(gè)子群落中，CRT陡度最高（|w|=0.047），演替速率最快，AT（|w|=0.034）次之，RT演替速率最慢（|w|=0.008）。結(jié)合WT演替速率（|w|=0.037），可以看出，CRT和AT是決定WT演替速率的主要菌群。Carvalho等[46]認(rèn)為群落β多樣性，即群落結(jié)構(gòu)演替變化由物種豐富度和物種豐度兩方面因素決定。使用STR和TDR兩種模型可分別從物種豐富度和物種豐度2個(gè)角度探究微生物群落在發(fā)酵過(guò)程中如何演替以及演替的內(nèi)驅(qū)菌群，并且對(duì)微生物演替的速度作定量描述。先前關(guān)于釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)演替的研究，主要聚焦于微生物系統(tǒng)分類(lèi)群如何隨時(shí)間或空間的變化而發(fā)生改變。本研究從群落演替的動(dòng)力角度入手，為深入剖析發(fā)酵過(guò)程群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，并通過(guò)演替速率間接認(rèn)識(shí)發(fā)酵動(dòng)力提供理論參考。
圖4 群落相似度與時(shí)間跨度關(guān)系曲線圖Fig. 4 Curves showing community similarity against time span
2.3 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析
利用Spearman相關(guān)性構(gòu)建共存網(wǎng)絡(luò)（圖5），網(wǎng)絡(luò)內(nèi)共有6 898個(gè)相互間顯著相關(guān)（q＜0.01）節(jié)點(diǎn)（OTU），816 922個(gè)連接邊。其中，AT節(jié)點(diǎn)24個(gè)，CRT節(jié)點(diǎn)4個(gè)，RT節(jié)點(diǎn)4 914個(gè)，其他節(jié)點(diǎn)1 956個(gè)。分別對(duì)AT、CRT、RT以及不屬于這3種子群類(lèi)型的其他子群（others）計(jì)算節(jié)點(diǎn)水平網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湎禂?shù)（表2），可以看出RT中介中心度、接近中心度和平均連接度均高于其他子群，且接近中心度和平均連接度顯著高于其他子群。此外，RT的平均最短路徑長(zhǎng)度也顯著短于其他子群。此結(jié)果表明RT相比其他子群更加處于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的中心位置，從而起到維持整個(gè)發(fā)酵微生態(tài)體系穩(wěn)定性的作用[19-20]。基于這一點(diǎn)，進(jìn)一步體現(xiàn)出RT高多樣性帶來(lái)的群落生態(tài)穩(wěn)定性特點(diǎn)。從平均聚類(lèi)系數(shù)上看，CRT稍高于AT，并且這兩個(gè)子群的平均聚類(lèi)系數(shù)明顯高于其他子群，顯著高于RT，表明CRT和AT中的細(xì)菌在各自子群內(nèi)相比其他子群中的細(xì)菌關(guān)聯(lián)程度更加緊密，具有更強(qiáng)的共存和相互協(xié)作性。此外，通過(guò)計(jì)算各子群在網(wǎng)絡(luò)水平的拓?fù)湎禂?shù)，可以看出AT和CRT的平均路徑長(zhǎng)度和網(wǎng)絡(luò)直徑明顯低于其他子群，而網(wǎng)絡(luò)密度明顯高于其他子群，進(jìn)一步說(shuō)明CRT和AT內(nèi)的微生物相互作用和聯(lián)系更加緊密。此外，從模塊化程度看，AT最高，表明AT與其他子群相比，區(qū)系化更強(qiáng)。
圖5 子群落間共存網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig. 5 Network showing co-occurrence patterns among sub-communities
表2 各子群在共存網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)湎禂?shù)Table 2 Topological coefficients of three sub-communities in co-occurrence network
2.4 群落演替與內(nèi)源理化因子間關(guān)系
酒醅內(nèi)源性理化因子，如乙醇、水分、乳酸、乙酸含量以及溫度都會(huì)因發(fā)酵過(guò)程微生物代謝方式或活性的改變而發(fā)生改變，進(jìn)而影響微生物群落的組成。為進(jìn)一步理解各子群的演替與內(nèi)源理化因子間關(guān)系，上述5個(gè)理化因子（表3）分別與各子群OTU相對(duì)豐度進(jìn)行CCA（圖6）。結(jié)果顯示，酒醅內(nèi)水分含量與AT演替顯著相關(guān)（P＜0.05，R2=0.09），AT由D1向D7的演替變化與水分含量呈正相關(guān)，隨后從D7向D8的演替與水分含量呈負(fù)相關(guān)，表明AT與酒醅水分含量關(guān)系密切。乙酸與RT演替顯著相關(guān)（P＜0.05，R2=0.05），且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程D1～D8，乙酸含量與RT呈負(fù)相關(guān)，表明RT的改變可能對(duì)乙酸含量影響較大。乙醇和乳酸含量與CRT演替顯著相關(guān)（P＜0.01，R2=0.52），且CRT從D1到D7的演替與溫度、乙醇和乳酸含量呈正相關(guān)，從D7到D8的演替與溫度呈正相關(guān)，與乙醇和乳酸含量呈負(fù)相關(guān)。此外，CRT的CCA模型R2至少是AT和RT的CCA模型R2的5 倍，表明CRT微生物對(duì)內(nèi)源環(huán)境因子的敏感性遠(yuǎn)高于其他微生物，因此發(fā)酵環(huán)境的改變最易影響CRT微生物的組成結(jié)構(gòu)，CRT的改變?cè)賹?duì)整個(gè)群落產(chǎn)生影響。對(duì)廢水、有機(jī)物、飲用水、農(nóng)林和土壤等微生態(tài)環(huán)境的微生物群落研究曾發(fā)現(xiàn)[19,20,35,47-48]，CRT環(huán)境中如同微生物種子庫(kù)，其種群密度會(huì)因環(huán)境條件的改變迅速擴(kuò)大或消耗殆盡，可作為關(guān)鍵微生物調(diào)節(jié)整個(gè)群落結(jié)構(gòu)，維持微生物間生態(tài)穩(wěn)定性；同時(shí)，某些CRT微生物可作為環(huán)境改變的信號(hào)，指示具體影響微生物動(dòng)態(tài)變化的物理、化學(xué)以及生物驅(qū)動(dòng)力。在本研究基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步探索CRT微生物，為調(diào)節(jié)、合理優(yōu)化發(fā)酵體系中微生物結(jié)構(gòu)另辟蹊徑。
表3 堆積發(fā)酵不同時(shí)段酒醅內(nèi)源理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical parameters of fermented grains at different stacking fermentation periods
圖6 各子群演替模式與內(nèi)源理化因子間CCA排序圖Fig. 6 CCA ordination describing the relationships between physicochemical factors and succession patterns of three sub-communities
3 結(jié) 論
本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合一定的數(shù)理統(tǒng)計(jì)手段，系統(tǒng)闡釋了AT、RT和CRT三類(lèi)細(xì)菌群在酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程中對(duì)WT演替的作用和影響，并得出相關(guān)結(jié)論：AT和CRT具有相似的演替模式，且AT決定WT的演替趨勢(shì)和方向，CRT對(duì)WT的演替起到一定推動(dòng)作用；WT演替速率主要由AT和CRT決定，WT物種積累數(shù)的縮減主要來(lái)自于RT的快速縮減；RT在WT中的演替相對(duì)獨(dú)立，并且是維持發(fā)酵過(guò)程微生態(tài)體系穩(wěn)定性的重要菌群，體系中環(huán)境的改變最易影響CRT組成結(jié)構(gòu)，致使CRT對(duì)總?cè)郝浣Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。
猜你喜歡
數(shù)學(xué)年刊A輯(中文版)(2022年1期)2022-08-20 08:50:50
昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(2022年2期)2022-03-29 00:51:58
食品安全導(dǎo)刊(2021年20期)2021-08-30 06:40:50
數(shù)學(xué)年刊A輯(中文版)(2021年4期)2021-02-12 01:21:00
食品安全導(dǎo)刊(2016年36期)2016-03-28 05:50:49
中國(guó)釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:23
中國(guó)釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:10
湖北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)(2015年1期)2016-01-10 08:41:12
哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)(2015年1期)2015-04-19 06:55:30
水生生物學(xué)報(bào)(2015年1期)2015-02-28 16:01:05
