李文杰，白艷紅,*，陳 曦*，米瑞芳，熊蘇玥，王守偉

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

傳統(tǒng)酸肉以豬肉為原料，采用自然發(fā)酵工藝生產(chǎn)，是侗族、苗族、布依族等少數(shù)民族的特色發(fā)酵肉制品，具有風(fēng)味獨(dú)特和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)酸肉通常采用自然接種的方式進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)所采取的工藝、環(huán)境條件和地區(qū)差異可以篩選和富集不同類型和代謝特征的微生物群落，從而產(chǎn)生多種多樣的風(fēng)味和功能組分。傳統(tǒng)酸肉中普遍存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬和微球菌屬等，真菌則以酵母居多，包括漢遜酵母屬、畢赤酵母屬等[2]。酸肉發(fā)酵過程中，微生物和內(nèi)源酶促使肌肉蛋白和脂肪發(fā)生降解，進(jìn)而產(chǎn)生酯類、醇類、酸類、游離氨基酸、抗氧化肽等多種風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-4]。

采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法生產(chǎn)酸肉，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。發(fā)酵肉制品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與肌肉蛋白分解和轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，利用外源添加的蛋白酶加速肌肉蛋白分解轉(zhuǎn)化，可在不損失營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味的前提下縮短發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)周期。目前外源蛋白酶在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用研究報(bào)道較多。例如，酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和脂肪酶的添加可將發(fā)酵香腸的生產(chǎn)周期縮短50%～60%[5]；酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和酯酶的添加可以改善發(fā)酵香腸的質(zhì)地、彈性和黏聚性，并提高產(chǎn)品的風(fēng)味感官品質(zhì)[6]；酸性蛋白酶的添加還可提高羊肉發(fā)酵香腸的紅度值，改善產(chǎn)品色澤及感官風(fēng)味品質(zhì)[7]。另外，中性蛋白酶和真菌蛋白酶的應(yīng)用可促進(jìn)具有抗氧化活性的小肽等化合物產(chǎn)生，從而提高發(fā)酵香腸提取物的抗氧化活性[8]。然而，目前尚無外源蛋白酶在酸肉生產(chǎn)中的應(yīng)用研究報(bào)道。

因此，為闡明外源蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)變化、理化特性和感官風(fēng)味品質(zhì)的影響，本研究通過高通量測(cè)序分析酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)利用氣相色譜-質(zhì)譜等方法分析酸性蛋白酶對(duì)酸肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸等重要理化指標(biāo)的影響，并對(duì)微生物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。本研究結(jié)果可為酶法發(fā)酵酸肉工藝提供參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬五花肉（肥瘦比3∶7） 北京中瑞食品有限公司；紅曲米 福建古田縣天鮮農(nóng)產(chǎn)品有限公司；食鹽、葡萄糖 市售；食品用酸性蛋白酶（50 000 U/g）安琪酵母股份有限公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒 德國(guó)Qiagen公司；C5～C20系列正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國(guó)Sigma公司；茚三酮顯色液、氨基酸混合標(biāo)樣 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；氦氣（＞99.999%） 北京氦普北方氣體工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-Wax MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、1310氣相色譜-TSQ 8000三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；57330-U手動(dòng)進(jìn)樣器、50/30 μm聚二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取針 美國(guó)Supelco公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 酸肉的制作

原料肉預(yù)處理（切成3 cm×5 cm×0.5 cm的薄片）→加入8%紅曲米、5%食鹽、1%葡萄糖和不同比例的酸性蛋白酶混勻→攪拌均勻→裝壇、密封→25 ℃發(fā)酵[9]

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：CG（對(duì)照組，不添加酸性蛋白酶）、E1（酸性蛋白酶25 U/g）和E2（酸性蛋白酶250 U/g）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組酸肉總質(zhì)量均為6 kg（每壇0.5 kg，共12 壇）。

1.3.2 酸肉的微生物、pH值、游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

酸肉發(fā)酵時(shí)間共計(jì)21 d。除0 d樣品直接取樣外，發(fā)酵7、14、21 d每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取3 壇樣品進(jìn)行微生物群落、pH值、游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定。

1.3.2.1 微生物群落檢測(cè)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取同一時(shí)間樣品3 份混勻，分別稱取混合樣品25 g，加入225 mL無菌生理鹽水，拍打均質(zhì)后4 ℃振蕩30 min，靜置10 min后取上清液離心收集沉淀。參考細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取樣品細(xì)菌群落總DNA；參考真菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取樣品真菌群落總DNA。DNA樣本經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)后，送至北京諾禾致源科技股份有限公司，分別采用341F和806R引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)、ITS5-1737F和ITS2-2043R引物擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)。高通量測(cè)序采用基于Illumina HiSeq技術(shù)平臺(tái)的雙端測(cè)序法。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后[10-11]，利用Uparse軟件以一致性97%作為標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[12]，利用QIIME軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)。

1.3.2.2 pH值測(cè)定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》方法。

1.3.2.3 游離氨基酸測(cè)定

參考張?zhí)K平等[13]的方法測(cè)定游離氨基酸含量，上機(jī)測(cè)定前經(jīng)0.22 μm過濾器過濾。

1.3.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

參照Montanari等[14]的方法并略做修改。稱取5 g酸肉，切碎后放于15 mL頂空瓶底部，加入3-辛醇（0.48 mg/mL）1 μL作為內(nèi)標(biāo)。將老化好的萃取針插入頂空瓶中，通過手柄推出石英纖維頭，使其暴露在頂空氣體中。將頂空瓶置于50 ℃恒溫水浴中萃取30 min后，將石英纖維頭推回針頭內(nèi)并拔出，然后插入進(jìn)樣口解吸5 min。

色譜條件：TG-Wax MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，氦氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230 ℃。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升至50 ℃；再以4 ℃/min升至120 ℃；最后以12 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度280 ℃，電離方式為電子電離，電子能量70 eV；全掃描模式采集信號(hào)，掃描質(zhì)量范圍35～400 u。

定性與定量分析：檢索NIST 11數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合C5～C20系列正構(gòu)烷烴混標(biāo)計(jì)算保留指數(shù)（retention index，RI），對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，利用內(nèi)標(biāo)3-辛醇計(jì)算揮發(fā)性化合物的含量。根據(jù)定量結(jié)果和文獻(xiàn)中報(bào)道的閾值[15]，計(jì)算得到香氣活性值（odor activity value，OAV）。

1.3.3 感官評(píng)定

參考冉春霞等[16]的方法對(duì)成熟酸肉進(jìn)行感官評(píng)定。由10 名發(fā)酵肉研究人員（男女各5 名）組成評(píng)價(jià)小組，按表1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

表1 酸肉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of sour meat

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的影響

2.1.1 細(xì)菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量和OTU分析

酸肉樣品所獲得的細(xì)菌序列條數(shù)平均值為78 391 條。如圖1所示，所有樣品的稀釋曲線都進(jìn)入平臺(tái)期，說明測(cè)序深度基本覆蓋樣品中所有細(xì)菌，符合分析要求。

圖1 酸肉樣品細(xì)菌稀釋曲線（A）和OTU數(shù)分布（B）Fig. 1 Rarefaction curves for bacteria (A) and distribution of bacterial OTUs in sour meat samples (B)

按照97%相似度對(duì)所有序列進(jìn)行聚類分析，共獲得686個(gè)OTU，涵蓋9 門241 屬。其中CG-0 d樣品的OTU數(shù)量最高，其他樣品的OTU數(shù)量相對(duì)較低，可見酸肉發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成發(fā)生了較大變化。

2.1.2 細(xì)菌群落α多樣性分析

對(duì)不同樣品在97%一致性閾值下的細(xì)菌群落α多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2），所有樣品的覆蓋率均大于0.99，說明測(cè)序結(jié)果可信。其中CG-0 d樣品的Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，這與Lü Jing等[18]對(duì)酸肉的研究結(jié)果類似，即0 d樣品的細(xì)菌多樣性在所有樣品中最高。這可能是由于發(fā)酵過程中乳桿菌等細(xì)菌逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，從而降低了樣品中細(xì)菌豐富度。整個(gè)發(fā)酵過程中，其他樣品的細(xì)菌多樣性呈波動(dòng)趨勢(shì)。

表2 酸肉樣品中細(xì)菌群落α多樣性Table 2 α-Diversity indexes of bacterial community in sour meat samples

2.1.3 細(xì)菌群落豐度分析

如圖2A所示，除0 d樣品，厚壁菌門（Firmicutes）是酸肉發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（95.38%～99.90%），這與其他研究報(bào)道一致[18-19]。在0 d樣品中，擬桿菌門（Bacteroidetes）是主要優(yōu)勢(shì)菌門（40.61%），原因在于酸肉中添加了紅曲米。紅曲米是以稻米為原料經(jīng)紅曲菌發(fā)酵而成，含有多種功能成分，包括紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等[20]。為改善酸肉色澤和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，本研究在酸肉中添加了紅曲米，而擬桿菌門是紅曲米中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[21]。

如圖2B所示，對(duì)于CG組酸肉，除0 d樣品，整個(gè)發(fā)酵過程中排名前3的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬為芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）。發(fā)酵7 d，CG組優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為芽孢桿菌（50.46%）和葡萄球菌（44.91%）；發(fā)酵14 d，乳桿菌成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（60.40%）；發(fā)酵結(jié)束時(shí)（21 d），優(yōu)勢(shì)菌仍為乳桿菌（57.6%），這與之前的研究報(bào)道一致[2,22-23]。酸肉自然發(fā)酵前期，芽孢桿菌和葡萄球菌等細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，將環(huán)境氧氣消耗殆盡，之后厭氧和兼性厭氧乳桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌，促使環(huán)境pH值急劇下降；隨著pH值的下降，不耐酸的葡萄球菌和芽孢桿菌生長(zhǎng)被抑制[22-23]，部分乳酸菌還能產(chǎn)生細(xì)菌素，進(jìn)一步抑制葡萄球菌和芽孢桿菌生長(zhǎng)[24]；發(fā)酵中期至結(jié)束，乳桿菌通常成為酸肉中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬[19,25-26]。

圖2 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的影響Fig. 2 Effect of acidic protease on bacterial community in sour meatduring fermentation

蛋白酶的添加影響了酸肉發(fā)酵過程中乳桿菌、芽孢桿菌和葡萄球菌的相對(duì)豐度。發(fā)酵7 d，與CG組類似，E1和E2組酸肉中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為芽孢桿菌（49.97%、68.30%）和葡萄球菌（44.37%、27.07%）；發(fā)酵14 d，與CG組不同，E1和E2組中葡萄球菌成為優(yōu)勢(shì)菌屬（57.36%、86.21%），乳桿菌相對(duì)豐度僅為20.90%和3.17%；發(fā)酵結(jié)束時(shí)（21 d），E1組與CG組類似，其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌，但E2組中乳桿菌豐度僅為3.90%，其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為芽孢桿菌（64.55%）。因此，發(fā)酵中期至結(jié)束（14～21 d），隨著酶添加量的增加，乳桿菌相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。原因可能是蛋白酶加快了肌肉蛋白的降解速率，產(chǎn)生了小肽、游離氨基酸和胺類等堿性物質(zhì)[27]，提高了pH值，促進(jìn)了芽孢桿菌和葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖。阿爾祖古麗·阿卜杜外力等[28]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶的添加可促進(jìn)干腌羊火腿中葡萄球菌屬的生長(zhǎng)；李文亞等[29]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶的添加可促進(jìn)蝦醬中芽孢桿菌的生長(zhǎng)，與本研究結(jié)果一致。推測(cè)由于蛋白酶促進(jìn)了芽孢桿菌和葡萄球菌相對(duì)豐度的上升，因此乳桿菌相對(duì)豐度有所下降。

2.2 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中真菌群落的影響

2.2.1 酸性真菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量和OTU分析

酸肉樣品所獲得的真菌序列條數(shù)平均值為80 108 條。如圖3A所示，所有樣品的稀釋曲線均進(jìn)入平臺(tái)期，說明測(cè)序深度基本覆蓋樣品中所有真菌，符合分析要求。

按照97%相似度對(duì)所有序列進(jìn)行聚類分析，共獲得773個(gè)OTU，涵蓋8 門143 屬。由圖3B可知，整個(gè)發(fā)酵過程中酸肉樣本的真菌OTU數(shù)量變化較小。

圖3 酸肉樣品真菌稀釋曲線（A）和OTU數(shù)分布（B）Fig. 3 Rarefaction curves for fungi (A) and distribution of fungal OTUs (B) in sour meat samples

2.2.2 真菌群落α多樣性分析

對(duì)不同樣品在97%一致性閾值下真菌群落的α多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表3），所有樣品的覆蓋率均大于0.99，說明測(cè)序結(jié)果可信。與細(xì)菌群落相比，酸肉發(fā)酵過程中真菌群落的Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)變化較小，原因在于紅曲米的添加使紅曲菌成為優(yōu)勢(shì)菌，導(dǎo)致發(fā)酵過程中真菌組成變化較小。

表3 酸肉樣品中真菌群落α多樣性分析Table 3 α-Diversity indexes of fungal community in sour meat samples

2.2.3 真菌群落豐度分析

酸肉發(fā)酵過程中，門水平上排名前3的真菌分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（圖4A），其中子囊菌門是包含紅曲菌的菌門。如圖4B所示，屬水平上排名前3的真菌分別為紅曲屬（Monascus）、毛霉屬（Mucor）和洛德酵母屬（Lodderomyces）。發(fā)酵過程中CG組酸肉真菌組成變化較大，發(fā)酵0 d優(yōu)勢(shì)真菌為紅曲屬，原因在于添加了紅曲米；發(fā)酵7 d為酵母（洛德酵母屬和紅酵母屬占比48.76%），發(fā)酵14 d為紅曲屬（55.86%），發(fā)酵結(jié)束時(shí)（21 d）為毛霉屬（66.23%）。傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中的真菌主要為酵母[2]。因此，紅曲米的添加顯著影響了酸肉自然發(fā)酵過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖4 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中真菌群落的影響Fig. 4 Effect of acidic protease on fungal community in sour meat during fermentation

酸性蛋白酶的添加顯著降低了酸肉的真菌豐富度。與CG組相比，添加酸性蛋白酶的酸肉中真菌組成變化較小，優(yōu)勢(shì)真菌均為紅曲屬（78.76%～97.94%）。目前尚無蛋白酶影響肉制品中紅曲屬生長(zhǎng)的研究報(bào)道。推測(cè)蛋白酶的添加促進(jìn)了小肽、游離氨基酸等堿性物質(zhì)產(chǎn)生，提高了酸肉pH值，從而促進(jìn)了紅曲屬生長(zhǎng)，如劉巧琳等[30]發(fā)現(xiàn)相對(duì)較高的pH值有利于紅曲屬的生長(zhǎng)。

2.3 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的影響

2.3.1 酸性蛋白酶對(duì)pH值的影響

發(fā)酵過程中，所有酸肉的pH值均呈先略升高后顯著下降的趨勢(shì)（圖5）。發(fā)酵7 d，所有酸肉pH值無顯著差異；發(fā)酵結(jié)束時(shí)（21 d），E2組酸肉pH值顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬和pH值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明乳桿菌和pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這可能是由于乳桿菌可顯著降低酸肉的pH值[9]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，E2組乳桿菌豐度最低，因此其pH值最高。

圖5 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中pH值的影響Fig. 5 Effect of acidic protease on pH of sour meat during fermentation

2.3.2 酸性蛋白酶對(duì)游離氨基酸的影響

如圖6A所示，酸性蛋白酶的添加影響了酸肉發(fā)酵過程中游離氨基酸總量。整個(gè)發(fā)酵過程中，所有酸肉的游離氨基酸總量均呈上升趨勢(shì)。蛋白酶加速了肌肉蛋白水解，促進(jìn)了游離氨基酸總量的增加，這與文獻(xiàn)[31]報(bào)道一致。游離氨基酸可作為風(fēng)味前體物質(zhì)，被乳酸菌、葡萄球菌等微生物轉(zhuǎn)化為醇、醛、酸等風(fēng)味物質(zhì)[32]。發(fā)酵結(jié)束后（21 d），所有實(shí)驗(yàn)組酸肉的游離氨基酸總量差異顯著（P＜0.05），氨基酸總量隨蛋白酶添加量的增加而增加。如圖6B所示，整個(gè)發(fā)酵過程中，所有酸肉的必需氨基酸總量呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)（21 d），酸肉必需氨基酸總量也隨蛋白酶添加量的增加而增加。必需氨基酸對(duì)人體維持生命至關(guān)重要，因此蛋白酶通過促進(jìn)游離氨基酸的釋放，提高了酸肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖6 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的影響Fig. 6 Effect of acidic protease on free amino acid contents in sour meat during fermentation

2.4 酸性蛋白酶對(duì)酸肉發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

酸性蛋白酶的添加提高了酸肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。如表4所示，所有酸肉中共檢出54 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酸類8 種、醇類12 種、醛類7 種、酯類13種、酮類6 種、含硫/含氮類2 種和芳香族類6 種。其中CG-0 d組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最少（23種）；E1-21d、E2-21 d組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最多，分別為41 種和39種。成熟酸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量隨蛋白酶添加量的增加而增加，E1-21 d、E2-21 d組酸肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量分別為CG-21 d組酸肉的3.17 倍和3.97 倍。蛋白酶的添加促進(jìn)了酸肉發(fā)酵過程中醇類的產(chǎn)生。與發(fā)酵7、14、21 d的CG組相比，發(fā)酵7、14、21 d的E1和E2組酸肉中乙醇、苯乙醇、戊醇、1-辛烯-3-醇等醇類含量有所提高，其中苯乙醇含量的增加是因?yàn)榈鞍酌傅奶砑哟龠M(jìn)了酸肉的氨基酸代謝，乙醇含量的增加可能是微生物代謝消耗酸肉中添加的葡萄糖，促進(jìn)了碳水化合物的分解[33]。整個(gè)發(fā)酵過程中，E1和E2組的乙酸含量均較CG組顯著提高（P＜0.05）。成熟酸肉（21 d）中3-甲基丁酸含量隨著蛋白酶添加量的增加呈上升趨勢(shì)，可能是由于蛋白酶促進(jìn)游離氨基酸產(chǎn)生，進(jìn)而內(nèi)源酶和微生物代謝氨基酸產(chǎn)生3-甲基丁酸[34]。

表4 酸肉發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 4 Contents of volatile compounds in sour meat during fermentation μg/kg

酯類物質(zhì)種類數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，如L-乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和庚酸乙酯僅在成熟酸肉（21 d）中檢測(cè)到。發(fā)酵結(jié)束后，僅在E1和E2組中檢測(cè)出乙酸乙酯、丁酸乙酯和庚酸乙酯。此外，E1和E2組成熟酸肉中3-甲基丁酸乙酯含量也較CG組顯著提高（P＜0.05），這可能由于蛋白酶促進(jìn)了部分醇類和酸類物質(zhì)形成，醇和酸發(fā)生酯化反應(yīng)促進(jìn)酯類產(chǎn)生[35]。酯類尤其是乙酯類物質(zhì)通常能賦予發(fā)酵肉果香味、奶油香味等良好風(fēng)味[36]。

蛋白酶的添加促進(jìn)了發(fā)酵過程中酮類物質(zhì)產(chǎn)生。整個(gè)發(fā)酵過程中E2組的3-羥基-2-丁酮顯著高于CG組（P＜0.05）。發(fā)酵結(jié)束后，僅在加酶組中檢測(cè)到3-戊烯-2-酮和2,4-戊二酮。另外，蛋白酶也促進(jìn)了苯甲醛等醛類物質(zhì)含量的提高。與本研究結(jié)果類似，封莉[37]發(fā)現(xiàn)在香腸中添加蛋白酶可促進(jìn)酮類物質(zhì)的產(chǎn)生，Yang Jing等[38]發(fā)現(xiàn)酸鲊魚中添加蛋白酶可將苯甲醛含量提高2.16 倍。

2.5 酸肉中優(yōu)勢(shì)微生物與關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析

通過OAV可以比較各種揮發(fā)性物質(zhì)的呈香能力，OAV大則表明該物質(zhì)對(duì)酸肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，是酸肉的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。如表5、圖7所示，酸肉中OAV大于1（即OAV對(duì)數(shù)值大于0）的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)共有17 種，分別為1-辛烯-3-醇、3-羥基-2-丁酮、3-戊烯-2-酮、3-甲基丁酸、丁酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己醛、

圖7 酸肉發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV熱圖Fig. 7 Heatmap for the odor activity values of volatile compounds in sour meat during fermentation

表5 酸肉發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 5 Volatile flavor compounds in sour meat during fermentation

苯乙醛、2,4-癸二烯醛、反-2,4-癸二烯醛和反-2-辛烯醛。這些物質(zhì)可賦予酸肉蘑菇香、青香、甜香、奶香味等，從而提升酸肉的風(fēng)味品質(zhì)[19]。

對(duì)酸肉中平均相對(duì)豐度大于1%的微生物和關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)之間進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，如圖8所示，與關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)呈顯著相關(guān)的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。乳桿菌屬與1-辛烯-3-醇呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這可能是由于酸肉中自然接種的部分乳桿菌可以抑制脂質(zhì)氧化，從而抑制了1-辛烯-3-醇產(chǎn)生，具體原因有待進(jìn)一步研究。芽孢桿菌屬與1-辛烯-3-醇呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這可能是由于芽孢桿菌有利于發(fā)酵肉中這些物質(zhì)的形成，例如黃雨霞等[39]研究發(fā)現(xiàn)，接種芽孢桿菌L-H7后，發(fā)酵香腸中1-辛烯-3-醇相對(duì)含量由未檢測(cè)到增加到1.71%。葡萄球菌與3-羥基-2-丁酮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。這可能是由于葡萄球菌的蛋白酶和脂肪酶活性有利于發(fā)酵肉制品中醇和酮類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成[32]。紅曲菌等真菌與關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)之間無顯著相關(guān)性。

圖8 酸肉中平均相對(duì)豐度大于1%的微生物和關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性Fig. 8 Correlation between microorganisms with an average relative abundance greater than 1% in sour meat and key flavor substances

2.6 酸性蛋白酶對(duì)成熟酸肉感官品質(zhì)的影響

酸性蛋白酶的添加提高了酸肉的總體感官品質(zhì)。如表6所示，E1、E2組的氣味、滋味和總體可接受性評(píng)分顯著高于CG組（P＜0.05），這是由于蛋白酶的添加促進(jìn)了蛋白質(zhì)的降解，提高了酸肉中醇、酯、醛等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，賦予了酸肉更濃郁的發(fā)酵香味。加酶組中，E2組的總體可接受性評(píng)分顯著高于E1組（P＜0.05），說明適量添加蛋白酶（250 U/g）有助于提高酸肉的感官品質(zhì)。

表6 酸性蛋白酶對(duì)成熟酸肉感官品質(zhì)的影響Table 6 Effect of acidic protease on the sensory quality of mature sour meat

3 結(jié) 論

添加蛋白酶的酸肉在微生物群落、游離氨基酸含量、揮發(fā)性風(fēng)味和感官品質(zhì)等方面都具有較大的差異。蛋白酶的添加提高了發(fā)酵過程中芽孢桿菌和葡萄球菌的相對(duì)豐度，降低了乳桿菌的相對(duì)豐度，并降低了真菌豐富度。蛋白酶促進(jìn)了酸肉游離氨基酸總量和必需氨基酸含量的提高，有利于提升酸肉的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。在所有酸肉樣品中共檢測(cè)到54 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，蛋白酶的添加提高了成熟酸肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，尤其是醇類、酸類、酯類和醛類物質(zhì)。適當(dāng)添加蛋白酶還可提高酸肉感官品質(zhì)。目前，尚無外源蛋白酶在酸肉中應(yīng)用的研究報(bào)道。本研究通過對(duì)酸肉微生物群落、游離氨基酸、感官風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，判斷出較為適宜的蛋白酶添加量，可為酸肉生產(chǎn)提供一定的參考。