王亞南，劉曉婷，樊占青，王哲人，高 欣，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

天冬氨酸族氨基酸被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化妝品、藥物等[1-2]，目前主要采用低成本、對環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)[3-4]。其代謝途徑受天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、高絲氨酸脫氫酶[5]、高絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶[6]和高絲氨酸巰基酶[7]調(diào)節(jié)，其中AK是影響碳流走向的首個關(guān)鍵限速調(diào)控點，將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到天冬氨酸（Asp），并生成天冬氨酰-4-磷酸[8]，最終轉(zhuǎn)化為賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）和甲硫氨酸（Met），因此AK對天冬氨酸家族氨基酸產(chǎn)物的積累具有至關(guān)重要的影響。為了優(yōu)化代謝途徑過量積累天冬氨酸族氨基酸，解除變構(gòu)抑制和提高酶的催化活性成為研究關(guān)注點[9-12]。

在已報道的生物體中，AK的晶體結(jié)構(gòu)主要為同型和異型寡聚體[13]，存在形式主要有單功能AK（AKI、AKII和AKIII）和雙功能AK-HSDH（I和II）[14]。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AK是一種高寡聚體，AKI受Lys和Met的抑制，AKII和AKIII只受Lys抑制[15-17]；在大腸桿菌（Escherichia coli）中的AKIII是同源二聚體，受Lys抑制[18]；而在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中的AKII受Lys和Thr協(xié)同抑制[19]，是由α和β亞基組成的異源四聚體（α2β2），α亞基在N末端包含一個催化結(jié)構(gòu)域，在C末端包含一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[20]。以上報道的AK均以多聚體形式存在，然而本實驗室發(fā)現(xiàn)北京棒桿菌中AK（C. pekinenseaspartate kinase，CpAK）呈單體狀態(tài)[21]，與谷氨酸棒桿菌中AK（C. glutamicumaspartate kinase，CgAK）具有98.78%的同源性，可基于CgAK的序列構(gòu)建CpAK的模型。

與CgAK相同，CpAK含有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域，包含Thr、Lys、ATP、底物Asp 4個關(guān)鍵配體。目前，多數(shù)研究對調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的抑制劑Lys結(jié)合位點進行定點突變[22-25]，對催化結(jié)構(gòu)域ATP、底物Asp結(jié)合位點的改造較少。本研究在各個配體周圍對4個關(guān)鍵殘基位點同時進行定點突變，篩選出有效解除反饋抑制的酶活力提高突變體T379N/A380C/T65I/D173G，通過無縫克隆技術(shù)構(gòu)建北京棒桿菌工程菌，旨在為構(gòu)建高產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒、菌株與試劑

大腸桿菌重組質(zhì)粒（pET-28a-AK）、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和BL21（DE3）、北京棒桿菌AS1.299均由實驗室提供；表達載體pEC-XK99E 湖南豐暉生物科技有限公司。

質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、Taq酶、核酸電泳Marker、DpnI消化酶 TaRaKa（大連）有限公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；非變性鎳柱柱料 美國GE公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、引物合成、測序由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；無縫克隆試劑盒MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2莫納（蘇州）生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母浸粉，1% NaCl；LB固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂。

北京棒桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基上另加0.3%甘氨酸，0.1%吐溫80。

北京棒桿菌電轉(zhuǎn)化恢復(fù)培養(yǎng)基：0.25%酵母浸提物，0.5%蛋白胨，0.5% NaCl，9.1%D-山梨醇，18.5%腦心浸液，固體培養(yǎng)基另加入2%瓊脂。

種子培養(yǎng)基：2.5%葡萄糖，2%玉米漿，0.1% KH2PO4，0.5% MgSO4，0.125%尿素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10%葡萄糖，2%玉米漿，2% (NH4)2SO4，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.001% MnSO4，0.001% FeSO4，0.000 1% VB1，0.000 6% VB6，0.02% VB12，0.000 01%生物素。

以上培養(yǎng)基均用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 德國Eppendorf AG公司；DYCP-31DN核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；Spectra Max 190酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司；超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK低溫高速離心機 德國Hermle公司；蛋白印記轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；SE260蛋白電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀 美國GE公司；L-8900高速氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 突變株的構(gòu)建

PCR擴增AK基因：運用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物為5’-GGTCGTGGTGGTTCTNNNACCACTGCAG TTG-3’，下游引物為5’-CGCAACTGCAGTGGTNNNAG AACCACCACG-3’，NNN表示飽和突變，合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。從重組大腸桿菌中提取pET-28a-AK質(zhì)粒并以其為模板，在引物作用下，經(jīng)94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，54～58 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（以上3 步循環(huán)18 次）；72 ℃保溫10 min完成突變PCR，并進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證。將驗證成功的PCR產(chǎn)物用DpnI酶37 ℃金屬浴消化2 h。轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主：將2 μL消化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入冰上預(yù)冷30 min的BL21感受態(tài)細胞，冰浴5 min，42 ℃熱激90 s，再冰上孵育2 min，加入不含卡那霉素的LB培養(yǎng)基900 μL，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)1.5 h，9 000 r/min離心2 min棄上清液800 μL，吹懸菌體后涂布于LB固體平板（含終質(zhì)量濃度為50 mg/L卡那霉素）上，37 ℃過夜培養(yǎng)。

高通量篩選：將單克隆菌株從抗性平板轉(zhuǎn)接到96 孔板中過夜培養(yǎng)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，在28 ℃、130 r/min培養(yǎng)12 h誘導(dǎo)蛋白表達。3 500 r/min離心45 min后棄上清液，加入100 μL磷酸鹽緩沖液反復(fù)吹打菌體，凍融破碎后測定其酶活性，高通量篩選出高酶活力的突變株，方法參考文獻[26]。以高酶活力菌株擴大培養(yǎng)的菌液為模板，在克隆引物作用下進行菌液PCR擴增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳進行菌液PCR產(chǎn)物驗證，并進行基因測序以證明突變株構(gòu)建成功。

1.3.2 蛋白表達與純化

以2%接種量將野生型（wild type，WT）和突變體菌株在100 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm達到0.7時，添加IPTG（終濃度1 mmol/L）100 μL，分別在25 ℃和28 ℃培養(yǎng)10 h誘導(dǎo)蛋白表達。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，菌體經(jīng)超聲破碎并離心后，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜處理后即為AK粗酶液，將其通過鎳柱分離純化，經(jīng)不同濃度咪唑溶液梯度洗脫去除雜蛋白后得到AK純化液。所得樣液變性后用SDS-PAGE和Western Blot驗證，具體方法參考文獻[12]。

1.3.3 酶動力學(xué)測定

用10 個不同濃度（0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）的L-Asp底物進行酶活力測定，并在520 nm波長處測吸光度，反應(yīng)體系及條件參考文獻[24]，計算比活力。通過Origin 8.5軟件與Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）進行非線性擬合。反應(yīng)速率V表示1 min內(nèi)1 mg酶的催化能力，Vmax表示酶完全被底物飽和時的最大反應(yīng)速率。

1.3.4 AK酶學(xué)性質(zhì)分析

最適溫度：底物濃度為3 mmol/L，反應(yīng)體系與酶活力測定相同，在不同溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃）條件下反應(yīng)30 min，最高酶活力定義為100%。

最適pH值：反應(yīng)體系同上，加入不同pH值的Tris-HCl緩沖液（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），最高酶活力定義為100%。

穩(wěn)定性：在得出的最適溫度和最適pH值條件下，其余反應(yīng)體系不變，反應(yīng)30 min后測定酶活力，0 h酶活力定義為100%，之后每隔1 h測定酶活力，共測10 次。

抑制劑對酶活力的影響：向反應(yīng)體系中加入不同的抑制劑（Thr、Lys、Met、Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met或Thr+Lys+Met），每種或多種抑制劑的最終濃度分別為0.2、1、5、10 mmol/L，以檢測抑制劑對AK活力的影響，添加水的對照組相對酶活力定義為100%。

1.3.5 工程菌構(gòu)建

獲得目的基因片段：提取WT和突變株T379N/A380C/T65I/D173G的質(zhì)粒為模板，在克隆引物作用下經(jīng)94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（以上3 步循環(huán)18 次）；72 ℃保溫10 min完成PCR擴增，并進行1%瓊脂糖核酸電泳，再進行膠回收獲得大量的目的基因。

線性化載體pEC-XK99E：提取質(zhì)粒獲得表達載體pEC-XK99E，線性化載體的反應(yīng)體系為EcoR I酶2 μL、BamH I酶2 μL、pEC-XK99E質(zhì)粒25 μL，將線性化載體進行1%瓊脂糖核酸電泳和膠回收。

無縫克隆連接：將膠回收的目的基因片段和線性化載體按以下體系進行無縫克隆連接：線性化載體1 μL、目的基因片段2 μL、Hi-Fusion Cloning Mix V2 2.5 μL，連接成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，操作方法同于轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)。

電轉(zhuǎn)化入北京棒桿菌：將提取測序成功菌株的質(zhì)粒5 μL加入北京棒桿菌感受態(tài)細胞，在冰上預(yù)冷10 min后全部轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，用20 kV電擊5 ms，加入LBHIS培養(yǎng)基洗滌后，30 ℃、100 r/min復(fù)蘇2 h，若菌濃度過低可延長復(fù)蘇時間。將復(fù)蘇的菌體于8 000 r/min離心2 min后棄去800 μL培養(yǎng)基上清液，剩余200 μL重懸后涂布于北京棒桿菌電轉(zhuǎn)化恢復(fù)固體培養(yǎng)基上（含卡那霉素），30 ℃倒置培養(yǎng)36 h，挑菌測序。

1.3.6 發(fā)酵及氨基酸含量測定

對WT和構(gòu)建的T379N/A380C/T65I/D173G菌株進行48 h菌株發(fā)酵培養(yǎng)，每6 h取樣，取氨基酸含量較穩(wěn)定的第30小時發(fā)酵液進行氨基酸含量測定[27-29]。取2 g樣品于20 mL水解管中，加入16 mL 6 mol/L鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，110 ℃水解22～24 h，取出冷卻開管，用去離子水無損轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶并定容。準(zhǔn)確取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干備用。上機前準(zhǔn)確加入1 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液，充分溶解，用0.22 μm的水相膜濾膜過濾后用高速氨基酸分析儀進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵突變位點的確定

本實驗室利用SWISS-MODEL構(gòu)建單體AK的三維結(jié)構(gòu)，使用ATP Bind server和COACH-D預(yù)測配體的結(jié)合位點，采用Auto Dock對配體進行對接，成功構(gòu)建的單體AK模型見圖1A[21]。利用Clustal X軟件對多個不同生物體內(nèi)的AK進行同源序列比對，用ESPript進行修飾比對結(jié)果，紅色部分表示高同源性保守位點（圖1B）。運用Discovery Studio 4.0軟件對AK模型進行分析，選取了不同配體周圍的4個位點進行定點突變：抑制劑Lys的結(jié)合位點Thr379和Aln380，Thr379與抑制劑Lys的羧基由氫鍵緊密連接；Ala380位點與Thr379緊密相連，且與抑制劑Lys通過水分子連接（圖1C）。Thr65通過氫鍵與底物Asp相連是關(guān)鍵的結(jié)合位點（圖1D）。文獻報道，甲烷球菌AK（Methanococcus jannaschiiAK，MjAK）（PDB：2hmf）的Asp211[29]和大腸桿菌（PDB：2j0w）的Asp202位點為催化活性中心位點[18]，利用SPDB軟件對幾種模型進行空間結(jié)構(gòu)比對，發(fā)現(xiàn)都對應(yīng)CpAK中Asp173位點，其位于底物Asp和ATP中間（圖1E）。

圖1 突變位點的確定Fig. 1 Determination of mutation sites

2.2 突變體構(gòu)建

定點突變PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖核酸電泳進行驗證，結(jié)果如圖2A所示，在7 000 bp左右有單一明亮條帶，證明目的基因擴增成功。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化作用后用熱激法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)BL21細胞中，采用高通量篩選方法篩選出高酶活力突變體，并進行菌液PCR，驗證結(jié)果如圖2B所示，在1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，與CpAK（1 317 bp）長度一致，證明目的基因AK已成功導(dǎo)入大腸桿菌菌株。對該菌株進行測序，測序結(jié)果與AK原序列比對見圖2C，Thr379、Ala380、Thr65、Asp173位點分別由Thr突變?yōu)樘於０罚ˋsn）、由Ala突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）、由Thr突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）、由Asp突變?yōu)楦拾彼幔℅ly），成功構(gòu)建了T379N/A380C/T65I/D173G突變體。

圖2 突變體T379N/A380C/T65I/D173G的構(gòu)建Fig. 2 Construction of mutant T379N/A380C/T65I/D173G

2.3 蛋白表達與純化

將誘導(dǎo)表達的WT和突變體菌株經(jīng)破碎、離心、過膜后進行非變性鎳柱純化，得到AK粗酶液和AK純化液，分別變性后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot驗證，結(jié)果見圖3，AK純化液在48 kDa左右處均有單一條帶，表明AK蛋白成功表達。

圖3 SDS-PAGE（A）及Western Blot（B）結(jié)果Fig. 3 Results of SDS-PAGE (A) and Western Blot (B)

2.4 反應(yīng)動力學(xué)分析

圖4 WT和T379N/A380C/T65I/D173G的動力學(xué)分析Fig. 4 Kinetic analysis of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

表1 WT及T379N/A380C/T65I/D173G動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

通過軟件Origin 8.5中的Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）進行非線性擬合得到Vmax、n和Km，WT和T379N/A380C/T65I/D173G的動力學(xué)參數(shù)分析如圖4和表1所示。T379N/A380C/T65I/D173G的Vmax為267.67 U/（mg·min），WT的Vmax為3.53 U/（mg·min），提高到75.83 倍。Km值表示當(dāng)反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，突變后AK的Km值由4.11 mmol/L降低至1.34 mmol/L，表明突變后與底物親和力增強。n值為Hill方程的希爾系數(shù)，代表協(xié)同性，其中n＜1表示負協(xié)同反應(yīng)；n=1表示非協(xié)同反應(yīng)：n＞1表示正協(xié)同反應(yīng)，酶對配體的親和力增大。AK的n值為1.71，突變體T379N/A380C/T65I/D173G的n值為1.07，n值降低，表明突變后AK的正協(xié)同性降低。

2.5 酶學(xué)性質(zhì)表征

2.5.1 溫度對AK活力的影響

如圖5A所示，WT AK最適溫度為25 ℃，突變后T379N/A380C/T65I/D173G AK的最適溫度為30 ℃，最適溫度提高5 ℃。在20～45 ℃溫度范圍內(nèi)，突變體相對酶活力仍保持在60%以上，而且當(dāng)溫度低于20 ℃或高于26 ℃時，突變后的酶活力均高于WT，表明突變改善了酶的耐受溫度性能，這對后期氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)有益。

圖5 WT和T379N/A380C/T65I/D173G的酶學(xué)性質(zhì)表征Fig. 5 Enzymatic properties of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

2.5.2 pH值對AK活力的影響

由圖5B可知，WT和T379N/A380C/T65I/D173G的AK最適pH值均為8.0，然而，突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK在pH 6～10條件下的相對酶活力均高于WT。

2.5.3 AK穩(wěn)定性分析

分別在WT和T379N/A380C/T65I/D173G AK的最適溫度和最適pH值條件下，測定酶穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5C所示。計算得到WT AK的半衰期為4.24 h，而T379N/A380C/T65I/D173G AK的半衰期為3.56 h，較WT AK縮短了0.68 h，突變導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性減弱。在前2 h和6 h后，突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK相對酶活力高于WT，10 h時突變體酶活力仍維持在20%左右，顯著高于此時的WT。

2.5.4 底物抑制劑對AK活力的影響

根據(jù)表2可知，WT AK受Lys、Thr和Met抑制，抑制作用與抑制劑濃度呈正相關(guān)。單個抑制劑Lys濃度為10 mmol/L條件下，抑制率最高為56.22%；由于Lys和Thr兩種抑制劑的共同作用，抑制效果最顯著達到69.68%，WT AK的相對酶活力為30.32%。CpAK的抑制機制與CgAK相似，都是通過Thr和Lys的協(xié)同反饋抑制。當(dāng)3種抑制劑共同作用時，最大抑制率為54.56%。突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK在大多數(shù)抑制劑濃度下都有抑制作用減弱甚至被明顯激活的趨勢：在不同濃度Lys、Lys+Thr存在時都起到激活作用，尤其是在5、10 mmol/L的底物抑制劑Lys+Thr+Met條件下，相對酶活力分別達到114.30%和119.42%，說明突變體有效地解除反饋抑制，并且激活作用以劑量依賴性的方式增強。

表2 底物抑制劑濃度對WT和T379N/A380C/T65I/D173G相對酶活力的影響Table 2 Effects of different concentrations of substrate inhibitors on the relative activity of WT and T379N/A380C/T65I/D173G%

2.6 工程菌構(gòu)建及發(fā)酵測氨基酸含量

提取WT和構(gòu)建成功的突變體T379N/A380C/T65I/D173G的質(zhì)粒進行PCR擴增，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證，結(jié)果如圖6A所示，1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，與目的基因（1 317 bp）長度一致。線性化載體pEC-XK99E的大小為7 018 bp，與圖6B條帶位置一致。將膠回收的目的基因片段和線性化載體無縫克隆連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，然后電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入北京棒桿菌中，質(zhì)粒的核酸電泳驗證結(jié)果如圖6C所示，并測序證明WT和突變體T379N/A380C/T65I/D173G北京棒桿菌構(gòu)建成功。

圖6 工程菌構(gòu)建的核酸電泳驗證Fig. 6 Nucleic acid electrophoresis verification of constructed engineering strains

取30 h的發(fā)酵液進行氨基酸含量測定，結(jié)果如表3所示。相較于WT，下游氨基酸產(chǎn)量提高：Lys積累量由0.59 g/L提升至1.08 g/L，提高了83.05%；Thr產(chǎn)量由1.09 g/L增加至1.41 g/L，增加了29.36%；Met產(chǎn)量由0.13 g/L提高到0.17 g/L，提高了30.77%，Asp產(chǎn)量由0.33 g/L下降至0.15 g/L，下降了54.54%。原因可能是AK的Lys結(jié)合位點、ATP結(jié)合位點及底物結(jié)合位點通過突變，有效地解除了Thr和Lys和協(xié)同反饋抑制，提高了酶活性，使碳流量更多地進入天冬氨酸族氨基酸的合成途徑，產(chǎn)量得以提高，然而突變后促進Asp流向三羧酸循環(huán)，從而使Asp積累量降低。

表3 發(fā)酵液中氨基酸產(chǎn)量Table 3 Amino acid contents in fermentation broth g/L

3 結(jié) 論

對關(guān)鍵位點Thr379、Aln380、Thr65、Asp173同時進行定點突變，成功篩選出獲得酶活力顯著提高到75.83 倍的AK突變體T379N/A380C/T65I/D173G，其與底物Asp的親和力增強。酶學(xué)性質(zhì)有利于菌株氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)：最適反應(yīng)溫度由25 ℃提升至30 ℃，耐熱性增強；最適pH值不變，酸堿耐受能力增強；半衰期由4.24 h縮短至3.23 h，穩(wěn)定性略微減弱；有效地解除抑制劑的反饋抑制作用。此外，成功構(gòu)建了北京棒桿菌工程菌，Lys產(chǎn)量達到1.08 g/L，Thr產(chǎn)量達到1.41 g/L，Met產(chǎn)量達到0.17 g/L，為優(yōu)化Asp代謝途徑和構(gòu)建高產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸提供參考。