吳雅嬌，邢又元，韓 娟*，吳嘉聰，李媛媛，王 赟,*

（1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003；3.江蘇大學(xué)京江學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003）

辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP，E.C.1.11.1.7）作為一種過氧化物酶，是由糖蛋白和褐鐵卟啉組成的植物糖蛋白[1]。HRP是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶[2]，目前已廣泛用于化學(xué)工程[3]、環(huán)境保護(hù)[4-5]、突變育種[6]、醫(yī)學(xué)診斷[7]和食品加工[8]等領(lǐng)域。辣根作為一種長年生香草，是HRP的主要來源。目前，HRP的純化技術(shù)一直集中在各種色譜技術(shù)上，例如苯基瓊脂糖凝膠CL-4B上的疏水相互作用色譜法[9]、伴刀豆球蛋白A瓊脂糖親和色譜法[10]、膨脹床離子交換色譜法[11]以及透析-凝膠過濾色譜法[12]等。然而，色譜技術(shù)既費(fèi)時(shí)又昂貴，大規(guī)模應(yīng)用受到限制。因此，開發(fā)一種操作簡單、成本低和選擇性好的純化HRP的新方法備受關(guān)注。

雙水相萃取已被證實(shí)是一種將分離、濃縮和純化集成的單元操作。雙水相體系（aqueous two-phase system，ATPS）是指將兩種互溶的物質(zhì)相混合，增加體系中物質(zhì)的濃度達(dá)到（或超過）臨界濃度后，原本互溶的均一體系會(huì)分成有明顯界限的兩相體系。雙水相萃取具有成本低、生物相容性好和易于擴(kuò)大等優(yōu)點(diǎn)。目前，聚合物-鹽ATPS已廣泛用于分離純化蛋白質(zhì)[13]，例如木瓜蛋白酶[14]、菠蘿蛋白酶[15]、卵清蛋白[16]和纖溶蛋白酶[17]。然而，盡管雙水相體系在分離純化蛋白質(zhì)方面有一定優(yōu)勢，但目標(biāo)蛋白質(zhì)選擇性差和聚合物價(jià)格昂貴仍然是其工業(yè)應(yīng)用的主要限制。

近年來，磁性氧化石墨烯（graphene oxide@Fe3O4，GO@Fe3O4）在分離純化蛋白質(zhì)領(lǐng)域表現(xiàn)優(yōu)異，引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。其中，GO比表面積大[18]，易于修飾和生物相容性好[19]，同時(shí)Fe3O4具有重復(fù)利用性，可降低分離成本[20]。因此，GO@Fe3O4納米材料是分離和純化蛋白質(zhì)的理想載體[21]。樹枝狀聚合物聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）具有豐富的官能團(tuán)，可作為GO@Fe3O4的主要支架增強(qiáng)材料和蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度?；诖?，本實(shí)驗(yàn)利用一種“多價(jià)”苯硼酸親和磁性石墨烯復(fù)合材料（d-PBA-GO@Fe3O4@PEI）作為進(jìn)一步純化糖蛋白的分離材料。一方面，磁性材料表面連接了苯硼酸基團(tuán)，苯硼酸與糖類化合物上的鄰二羥基或間二羥基能形成可逆硼酸酯鍵，這種酯鍵會(huì)受外界環(huán)境pH值的影響，弱堿性條件下形成，酸性條件下解離，使得磁性材料與糖蛋白具有特異性吸附；另一方面，樹狀聚合物PEI可以放大硼酸配體的數(shù)量，從而增加對糖蛋白的結(jié)合親和力。

基于此，本實(shí)驗(yàn)將雙水相萃取與親和吸附相結(jié)合，建立一種集成化方法用于植物中HRP的分離純化。首先以9種模型化合物為例，優(yōu)化兩步雙水相萃取體系的最佳條件，接著加入“多價(jià)”苯硼酸親和磁性石墨烯復(fù)合材料進(jìn)一步純化HRP，構(gòu)建適用于HRP分離純化的集成化方法。最終將該集成化方法用于植物辣根粗提液中，實(shí)現(xiàn)HRP的分離純化。該集成化方法具有優(yōu)異的分離純化性能，與傳統(tǒng)色譜技術(shù)相比，具有操作簡單和成本低的優(yōu)勢，對植物糖蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)具有良好的前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

17R4聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷（polypropylene oxide-polyethylene oxide-polypropylene oxide，PPO-PEO-PPO，相對分子質(zhì)量2 700）、(NH4)2SO4（純度≥99.0%）、磷酸氫二鉀（純度≥99.0%）、檸檬酸鉀（純度≥99.5%）、濃硫酸（純度98.0%）、高錳酸鉀和和葉綠素a（chlorophyll-a，CHL，純度≥85%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HRP（酶活力＞150 U/mg） 麥克林生化科技有限公司；細(xì)胞色素C（cytochrome C，CYT，來自牛心，純度≥95.0%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度96.0%）、花青素（anthocyanin，ANT，純度95.0%）、胡蘿卜素（carotene，CAR，純度≥95.0%）、黃芪多糖（astragalus polysaccharides，ASP，純度＞98.0%）、蔗糖（sucrose，SUC，純度≥99.0%）、果糖（fructose，F(xiàn)RU，純度99.0%）、石墨粉、六水合氯化鐵、氨水、七水合亞硫酸鐵、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、氰基硼氫化鈉、4-甲?；交鹚?阿拉丁生化科技股份有限公司。所有化學(xué)試劑無需進(jìn)一步純化即可使用。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S恒溫磁力攪拌器 河南省鞏義予華儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；RX-DD7折光率儀 日本愛拓公司；DDS 307A電導(dǎo)率儀上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 d-PBA-GO@Fe3O4@PEI的制備

根據(jù)本課題組前期的工作合成d-PBA-GO@Fe3O4@PEI[22]，得到的材料用磁鐵吸出，用水和乙醇洗滌，40 ℃干燥備用。

1.3.2 濁點(diǎn)的測定

制備一系列不同濃度的17R4純?nèi)芤杭凹尤臌}（K3C6H5O7/(NH4)2SO4/K2HPO4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）的混合溶液。將數(shù)字溫度計(jì)放入盛裝上述溶液的試管中并在恒溫水浴鍋中加熱，直到溶液變渾濁為止。然后將樣品從水浴鍋中取出并在室溫下冷卻。通過觀察捕捉濁度消失的突變點(diǎn)，以獲得溶液的濁點(diǎn)。溫度的誤差控制在0.1 ℃以內(nèi)，將3 次測定結(jié)果取平均值即為濁點(diǎn)。

1.3.3 液液相平衡的測定

通過滴定法測定17R4-鹽ATPS的液液相平衡數(shù)據(jù)。首先，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)已知的聚合物溶液加入到錐形燒瓶中，并浸入25 ℃恒溫水浴中。然后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)已知的鹽溶液滴入錐形瓶中，直到澄清溶液變渾濁為止。將去離子水滴加到燒瓶中以得到澄清溶液，并重復(fù)該過程。通過稱量法計(jì)算混濁點(diǎn)17R4（w1）和鹽（w2）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 9種目標(biāo)物在集成化方法中的分配

首先，將一定量的9種模型化合物（CHL、HRP、CYT、BSA、ANT、CAR、ASP、SUC、FRU）加入到17R4-鹽ATPS中，相平衡后，3種多糖分布到富鹽相中，而其他模型化合物富集在17R4富集相中，從而實(shí)現(xiàn)了糖類物質(zhì)的去除。其次，將檸檬酸鈉電解質(zhì)溶液添加至富17R4相中，調(diào)節(jié)其相間電位差后控溫形成17R4-檸檬酸鈉ATPS，此時(shí)蛋白質(zhì)分離進(jìn)入鹽富集相中，色素仍然保留在17R4富集相中，從而達(dá)到去除色素的目的。然后，在上述富鹽相中加入一定量的d-PBA-GO@Fe3O4@PEI吸附劑，調(diào)節(jié)最佳吸附條件，實(shí)現(xiàn)HRP與d-PBA-GO@Fe3O4@PEI的親和吸附，而其他兩種雜質(zhì)蛋白仍然保留在水相中。最后，調(diào)控吸附條件實(shí)現(xiàn)洗脫HRP。

1.3.5 植物辣根中HRP的分離純化

首先洗凈辣根（25 g），然后在4 ℃加入100 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.5），12 000 r/min勻漿5 次。抽濾后，將上述PBS添加至濾液中至200 mL。在冰水浴條件下，用超聲波（40 kHz）將溶液超聲處理3 次，每次20 min。搖動(dòng)后，將提取物4 ℃、8 000 r/min離心15 min，得到一定量的辣根粗提取物。將一定量辣根粗提物加入到兩步ATPS進(jìn)行初級純化，接著用d-PBA-GO@Fe3O4@PEI進(jìn)一步親和吸附HRP，最后得到純化后的HRP。

目標(biāo)物的酶活力回收率（Ye）、蛋白分布系數(shù)（Kp）、純化因子（PF）、分配系數(shù)（K）和提取效率（E）的計(jì)算如式（1）～（5）所示：

式中：Etop、Vtop和Me分別為上相的酶活力/（U/mL）、上相的體積/mL和初始總酶活力/（U/mL）；Mp、Ptop和Pbottom分別為初始蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）、上相和下相中的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；Ctop和Cbottom分別為目標(biāo)物在上相和下相中的平衡質(zhì)量濃度/（g/mL）；Ca、Va和ms分別為富集相中的目標(biāo)物質(zhì)量濃度/（g/mL）、富集相的體積/mL和目標(biāo)物的初始添加量/g。

1.3.6 目標(biāo)物的測定

用Micro BCATM蛋白測定試劑盒測定HRP、BSA和CYT的含量[23]；ASP、PUP和FRU含量通過苯酚-硫酸法測定[24]。

CAR測定：通過將25 mg CAR溶于少量三氯甲烷并用石油醚稀釋至100 mL，可得到250 μg/mL的CAR母液。然后通過稀釋CAR母液獲得不同質(zhì)量濃度（5、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過測量450 nm波長處的吸光度繪制CAR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用石油醚稀釋后，在450 nm波長處測定樣品溶液的吸光度。

ANT測定：將ANT（20 mg）溶于10 mL甲醇中，獲得ANT母液，并通過稀釋母液獲得不同質(zhì)量濃度（0.031 25、0.062 5、0.25、0.5、1 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后將2.5 mL硫酸添加至0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中，并通過分光光度計(jì)在500 nm波長下測定溶液吸光度以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品溶液用甲醇稀釋，并根據(jù)上述程序測定吸光度。

CHL測定：將CHL（10 mg）溶于100 mL乙醇中，以制備不同質(zhì)量濃度（10、20、30、40、50、60 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在652 nm波長處測定吸光度以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用乙醇稀釋后測定樣品溶液的吸光度。

1.3.7 酶活力測定

將一定質(zhì)量濃度HRP溶液0.1 mL轉(zhuǎn)移至底物溶液中，該底物溶液包含1.4 mL 4-氨基安替吡啉溶液和1.5 mL H2O2溶液。隨后，每1 min記錄一次510 nm波長處溶液的吸光度，直到每分鐘內(nèi)吸光度的增加達(dá)到穩(wěn)定值。HRP活力通過式（6）計(jì)算：

式中：E510nm為510 nm波長處每分鐘吸光度的增加量；V為反應(yīng)液的總體積/mL；ΔA為6.58，表示1個(gè)單位HRP能在1 min內(nèi)使吸光度提高6.58；Ew為0.1 mL酶溶液中酶質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，使用Excel 2010和Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，后用Duncan法進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05，差異顯著。作圖使用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 17R4濁點(diǎn)的分析

溫敏聚合物濁點(diǎn)研究是構(gòu)建溫敏聚合物-鹽ATPS的依據(jù)。17R4含量與濁點(diǎn)的關(guān)系如圖1所示，濁點(diǎn)會(huì)隨著17R4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低。由于膠束-膠束相互作用增加，膠束濃度增加從而使自由水成分相對減少，膠束則更容易團(tuán)聚。濁點(diǎn)在0.1% 17R4時(shí)達(dá)到最高（81 ℃），在10% 17R4時(shí)達(dá)到最低（25.5 ℃）。為考察鹽對濁點(diǎn)的影響，向17R4溶液中加入一定量的3種鹽（(NH4)2SO4、K3C6H5O7、K2HPO4），并分別測量其濁點(diǎn)變化。結(jié)果顯示3種鹽均會(huì)降低17R4的濁點(diǎn)。受鹽析能力的影響[25]，體系中的鹽會(huì)與聚合物競爭水分子，使膠束脫水并增強(qiáng)膠束間的作用力。因此，鹽可以降低聚合物溶液的濁點(diǎn)溫度。此外，每種鹽對濁點(diǎn)的影響也不同，這3種鹽改變濁點(diǎn)的能力排序如下：(NH4)2SO4＞K3C6H5O7＞K2HPO4。

圖1 17R4溶液的濁點(diǎn)與含量及鹽的關(guān)系Fig. 1 Relationship between cloud point and concentration of 17R4 solution with different salts

2.2 17R4-鹽ATPS的液液相平衡行為

實(shí)驗(yàn)測定了17R4-鹽ATPS的液液相平衡組成，如表1所示。當(dāng)ATPS分相后，17R4富集在ATPS的上相，鹽富集在ATPS的下相。增加鹽或聚合物的用量均使系線長度延長，有利于ATPS的液液相分離。通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7%～8%，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在13.2%～13.7%時(shí)的分相效果較好。從圖2可以看出，聚合物17R4質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的斜率均大于7%，相稀釋度更小，分相效果更佳。圖1表明鹽對17R4相分離的影響順序?yàn)?NH4)2SO4＞K2HPO4＞K3C6H5O7。由于鹽的水合作用比較強(qiáng)，與聚合物爭奪水分子，所以發(fā)生了相分離。對于此ATPS，無機(jī)鹽比有機(jī)鹽的分相效果強(qiáng)，(NH4)2SO4的鹽析能力最好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇8% 17R4-13.2%～13.7% (NH4)2SO4ATPS作為初級分離體系。

圖2 聚合物種類在25 ℃條件下對雙水相體系液液相平衡組成的影響Fig. 2 Effect of polymer type on the liquid-liquid equilibrium composition of two-phase aqueous system at 25 ℃

表1 17R4（w=7%/8%）-K3C6H5O7/(NH4)2SO4/K2HPO4ATPS在25 ℃的液液相平衡組成Table 1 Lliquid-liquid equilibrium data for 17R4 (w =7%/8%)-K3C6H5O7/(NH4)2SO4/K2HPO4 ATPSs at 293.15 K

2.3 9種模型化合物在17R4-鹽ATPS中的分配

由于植物中存在各種化學(xué)成分，有效分離和純化植物中的特定成分尤為困難。為選擇用于選擇性分離HRP的最佳ATPS，實(shí)驗(yàn)選擇3種模型化合物（包括多糖、色素和蛋白質(zhì)）研究ATPS作為初級純化步驟的效果。實(shí)驗(yàn)探究HRP、BSA、CYT、ASP、SUC、FRU、CHL、ANT和CAR在17R4-鹽ATPS中的分配情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖類物質(zhì)主要分布在鹽富集相，而色素和蛋白質(zhì)則傾向于分布在溫敏聚合物相。當(dāng)固定17R4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，3種鹽對9種模型化合物的分離效率影響順序?yàn)?NH4)2SO4＞K2HPO4＞K3C6H5O7。因此，選擇8% 17R4-(NH4)2SO4ATPS作為分離最佳體系。(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的改變對9種模型化合物分離效果見圖3。(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加會(huì)導(dǎo)致其鹽析作用增強(qiáng)，從而將目標(biāo)物驅(qū)動(dòng)分配到聚合物富集相。但(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高也會(huì)導(dǎo)致鹽富集相的黏度降低，從而導(dǎo)致傳質(zhì)效率和提取效率的降低。因此，實(shí)驗(yàn)選擇8% 17R4-13.2% (NH4)2SO4ATPS作為HRP的初步純化體系。此時(shí)9種模型化合物在聚合物富集相的最佳提取效率分別為：（88.88±2.82）%（HRP）、（75.78±2.76）%（BSA）、（74.16±2.64）%（CYT）、（94.96±2.32）%（CHL）、（94.96±3.12）%（ANT）、（87.05±3.46）%（CAR）、（7.64±3.14）%（SUC）、（10.12±2.79）%（ASP）和（2.01±1.52）%（FRU）。

圖3 9種目標(biāo)物在8%17R4-(NH4)2SO4ATPS中的分配效果Fig. 3 Partition efficiency of nine target compounds in 8%17R4-(NH4)2SO4 ATPS

2.4 17R4-Na3C6H5O7 ATPS進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)和色素

將9種模型化合物分配到17R4-(NH4)2SO4ATPS后，蛋白質(zhì)和色素分離富集到溫敏聚合物17R4相中。為了進(jìn)一步分離色素和蛋白質(zhì)，將電解質(zhì)添加到ATPS中，然后將蛋白質(zhì)反萃取到富鹽相中。根據(jù)先前關(guān)于電解質(zhì)調(diào)節(jié)對ATPS中蛋白質(zhì)分布影響的研究，通過添加電解質(zhì)可以產(chǎn)生不同的靜電勢（相間勢）[26]。由于蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)取決于pH值，可以通過操縱電解質(zhì)和pH值調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的分配。因此，研究Na3C6H5O7、Na2SO4和NaCl 3種電解質(zhì)對蛋白質(zhì)分配的影響?？紤]到鹽析作用的影響，控制體系中電解質(zhì)的濃度為100 mmol/L以消除鹽析作用的影響，同時(shí)具有最大化相間電位的作用[27]。為充分了解外加電解質(zhì)對體系蛋白質(zhì)分配的過程影響，以加入Na3C6H5O7為例進(jìn)行詳細(xì)介紹。對疏水性的凝聚相具有較強(qiáng)的親和性，故向體系中加入Na3C6H5O7時(shí)，主要分配于體系下相，從而在兩相間產(chǎn)生相間電位差。在此電勢的作用下，體系中帶正電的物質(zhì)會(huì)富集于體系的凝聚相，同時(shí)，體系中帶負(fù)電物質(zhì)則被排斥到體系稀釋相。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大多為酸/中性左右，而當(dāng)體系pH值為8.0時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。此時(shí)，加入Na3C6H5O7所產(chǎn)生的相間電位會(huì)對蛋白質(zhì)產(chǎn)生排斥作用，進(jìn)入稀釋相。另外，當(dāng)體系pH值為7（接近等電點(diǎn)）時(shí)，蛋白質(zhì)幾乎不帶電，加入Na3C6H5O7產(chǎn)生的相間電位并不會(huì)對蛋白質(zhì)在兩相間分配以及蛋白質(zhì)回收率產(chǎn)生顯著影響。如圖4所示，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，加入Na3C6H5O7對蛋白質(zhì)去除率造成的影響均與上述結(jié)論相符，從而驗(yàn)證了前文論述的正確性，并證實(shí)了借助調(diào)節(jié)體系pH值與外加電解質(zhì)調(diào)節(jié)荷電物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）在兩相間分配的可行性。另外，還向體系中加入Na2SO4和NaCl以研究和Cl-對體系蛋白質(zhì)和色素回收率的影響，結(jié)果如圖4所示。可知不同電解質(zhì)離子的疏水性序列如下：該序列與文獻(xiàn)所述相符，從而論證了上述理論的準(zhǔn)確性[28]。因此，當(dāng)Na3C6H5O7添加到ATPS中時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)從富含17R4的相進(jìn)入富含鹽的相，因此通過這種反萃取操作實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)和色素的分離。富鹽相中HRP、BSA和CYT 3種蛋白質(zhì)的提取效率分別為（75.43±1.26）%、（73.80±1.73）%和（70.38±2.33）%，而鹽富集相中ANT、CAR和CHL3種色素的提取效率分別為（1.07±0.33）%、（1.37±0.21） %和（2.11±0.38）%。此步驟成功實(shí)現(xiàn)了從蛋白質(zhì)中去除色素的目的。

圖4 外加電解質(zhì)對體系蛋白質(zhì)和色素回收率的影響Fig. 4 Influence of added electrolyte on recoveries of protein and pigment

2.5 苯硼酸親和吸附材料進(jìn)一步純化HRP

課題組前期合成了一種樹枝狀“多價(jià)”苯硼酸親和磁性石墨烯復(fù)合材料d-PBA-GO@Fe3O4@PEI用于HRP的分離，選擇性分離效果令人滿意[22]。GO比表面積大，且表面含有豐富的官能團(tuán)，擁有較強(qiáng)的生物相容性，可以被其他功能聚合物修飾改性。GO的這些優(yōu)異特性為蛋白酶的吸附提供了空間以及活性位點(diǎn)，同時(shí)，F(xiàn)e3O4具有特定的磁性結(jié)構(gòu)和可回收特性，可重復(fù)利用，從而降低蛋白質(zhì)分離的成本[29]。樹狀聚合物PEI用于增強(qiáng)磁性材料與糖蛋白的結(jié)合強(qiáng)度。由于其獨(dú)特的特性，豐富的官能團(tuán)和易于修飾，樹枝狀PEI被選作磁性材料的主要支架。而且，PEI鏈上的豐富氨基還可以改善材料的親水性，并有助于減少非糖蛋白的吸附。同時(shí)，還在磁性材料表面連接了苯硼酸基團(tuán)，使材料與糖蛋白特異性吸附。PEI已被證明是一種出色的支架，可以放大硼酸配體的數(shù)量，從而增加對糖蛋白的結(jié)合親和力。根據(jù)前期的討論結(jié)果[22]，d-PBA-GO@Fe3O4@PEI吸附HRP的最佳條件為：HRP質(zhì)量濃度0.9 mg/mL、吸附pH 8.0、吸附溫度35 ℃以及吸附時(shí)間60 min。當(dāng)吸附完全后，磁性回收吸附劑和酶，加入一定量的100 mmol/L乙酸溶液，懸浮1 h，用以洗脫吸附劑上的HRP。通過以上兩步ATPS純化和d-PBA-GO@Fe3O4@PEI進(jìn)一步分離純化HRP后，計(jì)算得到HRP的提取效率為（70.30±2.08）%，BSA和CYT的提取效率分別為（8.11±0.35）%和（7.07±0.75）%，成功實(shí)現(xiàn)HRP的選擇性分離。

2.6 辣根中HRP的分離純化

通過將構(gòu)建的集成化方法用于從辣根粗提液中選擇性分離HRP，驗(yàn)證該集成方法對HRP分離純化的有效性。結(jié)果表明，純化因子為1.92，比活力為28.93 U/mg，萃取回收率為（65.20±1.15）%。此外，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）證明純化效果。如圖5所示，辣根粗提液中存在許多蛋白質(zhì)雜質(zhì)。17R4-(NH4)2SO4ATPS提取后，蛋白質(zhì)雜質(zhì)減少，如SDSPAGE的第L道所示。當(dāng)加入d-PBA-GO@Fe3O4@PEI進(jìn)一步吸附分離后，洗脫液中有明顯的HRP條帶，證明該集成化方法在從辣根中分離和純化HRP方面顯示出良好的性能。

圖5 辣根粗提取物中提取HRP的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of horseradish peroxidase extracted from crude horseradish extract

2.7 純化后HRP的結(jié)構(gòu)分析

用紅外光譜和圓二色譜分析純化后HRP的結(jié)構(gòu)變化。HRP的二級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在1 649 cm-1和1 541 cm-1的酰胺帶上[30]。從圖6a可以看出，純化后HRP和商品化HRP的酰胺帶峰位置相同，純化后HRP和商品化HRP的其他峰位也基本相似。如圖6b所示，作為HRP的共同特征，208 nm和222 nm處的負(fù)峰是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，而大約196 nm處的正峰屬于β-折疊結(jié)構(gòu)。通過對比二者的光譜結(jié)構(gòu)，可以充分證明本實(shí)驗(yàn)的集成化方法對HRP結(jié)構(gòu)沒有影響。

圖6 純化后及商品化HRP的紅外光譜（a）和圓二色譜（b）圖Fig. 6 FT-IR spectra (a) and CD spectra (b) of purified HRP and commercial HRP

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了17R4-(NH4)2SO4/K2HPO4/K3C6H5O7溫敏雙水相萃取體系，探討并優(yōu)化了用于純化蛋白質(zhì)的條件；模擬辣根中未知的物質(zhì)和環(huán)境研究9種目標(biāo)物在雙水相體系種的分配情況，發(fā)現(xiàn)采用17R4-(NH4)2SO4ATPS在辣根粗酶液中初步分離純化HRP可得到（75.43±1.26）%的提取效率。最后在粗提液中加入d-PBA-GO@Fe3O4@PEI磁性材料選擇性吸附HRP，純化后的HRP純化因子為1.92，比活力為28.93 U/mg，萃取回收率為（65.20±1.15）%，得到了較為滿意的純化結(jié)果。