朱紅俊 陸曙 蘇偉 龔少愚

(南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院心血管科，江蘇 無錫 214071)

對于非高危肺血栓栓塞癥，年齡增長和疾病嚴(yán)重程度明顯相關(guān)〔1〕；對于前列腺癌患者，不同年齡對疾病的不確定感和生活水平有顯著差異〔2〕。對于動脈粥樣硬化，年齡是獨立的危險因素。動物年齡越大，其血管對高脂血癥損傷也越敏感〔3〕。本研究從核因子(NF)-κB信號通路角度，探討這種現(xiàn)象中炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制，證實年齡對炎癥信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只8周齡清潔級雄性SD大鼠由江蘇省血吸蟲病防治研究所動物實驗中心提供和飼養(yǎng)，平均體重(220±20)g。分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(22±4)℃,光照與黑暗循環(huán)時間為12 h。本研究均采用普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，由動物實驗中心提供。

1.2實驗試劑及儀器 20%烏拉坦及Invitrogen Trizol購自中國蘇州碧麗雅生物科技有限公司；柱式細(xì)胞和組織總RNA抽提試劑盒購自中國上海博彩生物科技有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購自中國北京生物技術(shù)研究所；無Ca、Mg的Hank液購自中國蘇州科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自美國Blue Gene公司；LightCycler480聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購自德國 ROCHE。

1.3分組與給藥方法 所有大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。每周稱大鼠體重。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，剔除飼食異常者。在第9周齡、第13周齡、第21周齡，分別隨機(jī)抽取10只大鼠，留取外周血、大動脈、心臟組織等實驗標(biāo)本。

1.4樣品采集與預(yù)處理 取樣時，采用20%烏拉坦腹腔注射麻醉。打開腹腔，從下腔靜脈，采用5 ml無菌注射器抽取4 ml靜脈血，分別注入生化管和85 U肝素鋰抗凝的真空采血管各2 ml，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行外周血單個核細(xì)胞分離及RNA提取。留取大動脈(含升主動脈、主動脈弓、降主動脈)、心臟左心室(保留冠狀動脈)心肌組織，0.9%生理鹽水沖洗，分別置入含甲醛1 ml的2 ml凍存管(常溫保存)及不含甲醛的2 ml凍存管，-80℃的冰箱保存待檢。甲醛固定的大血管、左心室組織送至醫(yī)院病理科進(jìn)行取材、包埋。冰凍保存的組織樣本根據(jù)試劑說明書進(jìn)行組織勻漿制備及RNA的提取。

1.5指標(biāo)檢測 (1)外周血單個核細(xì)胞及左心室組織Toll樣受體(TLR)-4 mRNA表達(dá) 根據(jù)文獻(xiàn)方法〔4〕采用RT-PCR進(jìn)行，通過溶解曲線、2%瓊脂糖凝膠電泳和基因測序確定產(chǎn)物表達(dá)的準(zhǔn)確性，TLR-4 mRNA的表達(dá)程度采用相對定量計算，以13周齡大鼠檢測值為標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)化比值計算公式采用2-△△Ct法〔5〕。檢測方法：管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，大鼠目的基因和內(nèi)參基因引物序列：TLR-4正義鏈：5′-AGAATGAGGACTGGGTGA-3′,反義鏈：5′-AGCGGCTACTCAGAAACT-3′；β-actin正義鏈：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′,反義鏈：5′-ACA TCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。(2)血清及左心室組織NF-κB水平、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進(jìn)行檢測。檢測流程根據(jù)試劑說明書進(jìn)行。(3)血脂水平 血脂〔總膽固醇(TC)、三酯甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)〕水平檢測，由醫(yī)院檢驗科采用氧化還原方法測定。

1.6組織學(xué)染色 (1)大鼠主動脈血管厚度 主動脈標(biāo)本在主動脈弓根部取材，甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片5個，蘇木素-伊紅(HE)染色。鏡下測量外膜基膜至血管內(nèi)膜表面的最大垂直厚度。(2)左心室組織多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1的表達(dá)：采用免疫組化方法進(jìn)行檢測，檢測方法參考文獻(xiàn)〔6，7〕進(jìn)行。每個標(biāo)本在鏡下隨機(jī)觀察相互不重疊的視野各4個，計算每個視野陽性細(xì)胞均數(shù)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析及Pearson相關(guān)性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1病理及免疫組化檢測結(jié)果 大鼠主動脈壁厚度和PARP-1陽性細(xì)胞數(shù)隨著大鼠周齡增加而增加(均P<0.05)。見圖1，表1。

2.2NF-κB信號通路相關(guān)指標(biāo) 大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB、血清IL-6水平隨著大鼠周齡增加而增加(P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB水平、血清IL-6水平均和大鼠周齡呈正相關(guān)(r=0.973，0.988，0.978，均P<0.05)。見表1。

2.3血脂水平 大鼠TC、LDL-C水平隨著大鼠周齡增加而增加(P<0.05)。大鼠血脂TC、LDL-C水平和大鼠周齡呈正相關(guān)(r=0.992，0.994,均P<0.05)，見表1。

表1 不同周齡大鼠主動脈厚度與信號通路檢測及炎癥因子的檢測結(jié)果

3 討 論

年齡和多種疾病相關(guān)，年齡的增長可以在多個維度影響動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，隨著年齡的增加，肥胖率降低而高血壓患病率增加〔8〕。本研究結(jié)果表明，大鼠動脈粥樣硬化程度與年齡相關(guān)。PARP和動脈粥樣硬化、冠心病等病理過程中細(xì)胞程序性死亡有關(guān)〔9〕，并調(diào)節(jié)著多種炎癥因子〔10〕的表達(dá)。而通過調(diào)控NF-κB來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)是TLR-4調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制之一。通過MyD88依賴和MyD88非依賴兩條途徑，TLR-4調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活性，介導(dǎo)下游IL-6等炎癥因子的水平。

綜上，大鼠年齡增長和動脈粥樣硬化的NF-κB炎癥信號通路之間具有緊密的相關(guān)性。