廖全輝 王水蓉 黃 龍 蔡 雪 付天明 李科興

1.成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院兒科，四川成都 610100；2.成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，四川成都 610100；3.成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院新生兒科，四川成都 610100

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與，以氣道慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，是兒童期最常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]。當(dāng)前我國(guó)兒童BA 的診治雖然取得較大進(jìn)展，但仍有30%的患兒未能及時(shí)診斷，超過(guò)20%的患兒未達(dá)到良好控制，因此，BA 防治等相關(guān)領(lǐng)域一直是研究熱點(diǎn)[2-3]。研究顯示，T 淋巴細(xì)胞在BA 氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥中發(fā)揮重要作用，其中輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1 和Th2 比例失衡是BA 發(fā)生的重要基礎(chǔ)[4]。非編碼RNA 是一類不編碼蛋白質(zhì)RNA，具有調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)等作用，與BA 發(fā)生密切相關(guān)[5-9]。微小RNA（microRNA，miR）-138 是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，已有研究證實(shí)其參與過(guò)敏性哮喘、骨關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[10-11]，但關(guān)于其在兒童BA 中的作用尚不明確。本研究分析BA 患兒外周血miR-138 表達(dá)與Th1/Th2 平衡的關(guān)系，以期為BA 防治提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）2020 年1 月至2021 年3 月收治的103 例BA 患兒為研究對(duì)象，根據(jù)臨床表現(xiàn)分為急性發(fā)作期組（42 例）和臨床緩解期組（61 例）。急性發(fā)作期組男22 例，女20 例；年齡2～12 歲，平均（7.52±2.54）歲。臨床緩解期組男33 例，女28 例；年齡3～13 歲，平均（7.48±2.57）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》[12]中BA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡＜14 歲；③患兒家屬或監(jiān)護(hù)人知情研究并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天氣道、肺組織發(fā)育異常；②合并支氣管擴(kuò)張、過(guò)敏性鼻炎、呼吸衰竭、肺結(jié)核、氣道內(nèi)阻塞性疾病；③近2 周內(nèi)呼吸道感染史；④近4 周內(nèi)糖皮質(zhì)激素使用史；⑤血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病。另選取我院同期82 名體檢健康兒童為對(duì)照組，其中男44 名，女38 名；年齡1～12 歲，平均（7.50±2.63）歲。三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miR-138 和Th1、Th2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平測(cè)定 采集BA 患兒入院時(shí)及對(duì)照組體檢時(shí)外周血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝，取3 ml 外周血，Trizol 總RNA 抽提試劑（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)：R1030）提取外周血總RNA，TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號(hào)：RR036A）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，miR-138 正向引物：5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，反向引物：5’-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG-3’；T-bet 正向引物：5’-TGTGACCCAGAGATTGTCT-3’，反向引物：5’-TGCGTGTTGGAAGCGTTG-3’；GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）正向引物：5’-CGGCAGGACGAGAAAGAGT-3’，反向引物：5’-TAGGGCGGGTAGGTGGTGA-3’。反應(yīng)體系（總體積10.0 μl）：5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，引物各0.3 μl，1.0 μl cDNA，3.4 μl ddH2O；擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性90 s，循環(huán)1 次，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次。以U6 作為內(nèi)參，正向引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，2-ΔΔCt法計(jì)算外周血miR-138、T-bet、GATA3 相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 外周血Th1、Th2 百分比和相關(guān)細(xì)胞因子測(cè)定取外周血1 ml 抗凝，RPMI-1640 培養(yǎng)基等體積稀釋外周血100 μl，加入10 μl 刺激劑，5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育4 h，加入CD3-PC5 抗體、CD8-PC7 抗體，避光孵育15 min，裂解，破膜，加入白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）-PE 抗體、γ 干擾素（interferon-γ，INF-γ）-FITC抗體，避光孵育20 min，洗滌后賽默飛Attune NxT流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th1、Th2 百分比，并計(jì)算Th1/Th2。取2 ml 外周血，3000 r/min 離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、T-bet 試劑盒購(gòu)于上海富雨生物科技有限公司（貨號(hào)：FY-03183H2、FY-03181H2、FY-03188H2、FY-04313H1、FY-04432H2）；GATA3 試劑盒購(gòu)于上海信帆生物科技有限公司（貨號(hào)：XFH10177）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較SNK-q 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血miR-138 表達(dá)、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比較

急性發(fā)作期組外周血miR-138 表達(dá)、Th2 百分比高于臨床緩解期組、對(duì)照組，Th1 百分比、Th1/Th2 低于臨床緩解期組、對(duì)照組（P ＜0.05）；臨床緩解期組外周血miR-138 表達(dá)、Th2 百分比高于對(duì)照組，Th1百分比、Th1/Th2 低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組外周血miR-138 表達(dá)、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比較（）

表1 三組外周血miR-138 表達(dá)、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與臨床緩解期組比較，bP ＜0.05。Th：輔助性T 細(xì)胞

2.2 三組外周血Th1、Th2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平比較

急性發(fā)作期組外周血T-bet 水平低于臨床緩解期組、對(duì)照組，GATA3 水平高于臨床緩解期組、對(duì)照組（P ＜0.05）；臨床緩解期組外周血T-bet 水平低于對(duì)照組，GATA3 水平高于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組外周血Th1、Th2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平比較（）

表2 三組外周血Th1、Th2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與臨床緩解期組比較，bP ＜0.05。Th：輔助性T 細(xì)胞

2.3 三組外周血Th1、Th2 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

急性發(fā)作期組外周血IL-2、IFN-γ 水平低于臨床緩解期組、對(duì)照組，IL-4、IL-10 水平高于臨床緩解期組、對(duì)照組（P ＜0.05）；臨床緩解期組外周血IL-2、IFN-γ水平低于對(duì)照組，IL-4、IL-10 水平高于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組外周血Th1、Th2 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（ng/ml，）

表3 三組外周血Th1、Th2 相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（ng/ml，）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與臨床緩解期組比較，bP ＜0.05。Th：輔助性T 細(xì)胞；IL：白細(xì)胞介素；IFN-γ：γ 干擾素

2.4 BA 患兒外周血miR-138 表達(dá)與T-bet、GATA3和Th1/Th2 及相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性

BA 患兒外周血miR-138 表達(dá)與T-bet、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.498、-0.515、-0.464、-0.428，P ＜0.01），與GATA3、IL-4、IL-10 呈正相關(guān)（r=0.595、0.518、0.386，P ＜0.01）。

3 討論

BA 是兒童呼吸內(nèi)科常見(jiàn)病，隨著病情進(jìn)展可發(fā)展為氣道重塑，引起氣道增厚狹窄，甚至阻塞性通氣功能障礙，威脅患兒生命安全，積極探索其發(fā)病機(jī)制對(duì)早期診斷和提升治療效果意義重大。BA 發(fā)病機(jī)制可概括為氣道炎癥-免疫、遺傳、神經(jīng)調(diào)節(jié)，其中氣道炎癥-免疫機(jī)制是由多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、炎癥細(xì)胞共同參與和相互作用的結(jié)果[13]。Th 是調(diào)控免疫和炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞，Th1、Th2 均來(lái)源于Th 亞群，研究顯示，Th1/Th2 失衡在BA 發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[4]，但關(guān)于Th1/Th2 平衡與BA 發(fā)病相關(guān)靶基因的生物標(biāo)志物研究較少。

miRNA 是一類長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，具備轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能，可通過(guò)調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)，參與BA 的發(fā)生發(fā)展[14]。miR-138位于人染色體3p21.32，既往研究多報(bào)道其在多種實(shí)體腫瘤中的作用[15-16]。Wei 等[17]研究顯示，miR-138 能結(jié)合細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)分子4、細(xì)胞程序性死亡受體1 的3’-非翻譯區(qū)參與相關(guān)免疫反應(yīng)過(guò)程。Shao 等[18]研究顯示，miR-138 能通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；讣せ詈艘蜃?κB 信號(hào)通路，促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，BA 患兒外周血miR-138 表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示miR-138 參與BA發(fā)生。急性發(fā)作期是指BA 突然發(fā)生或原有BA 癥狀加重，本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期患兒外周血miR-138表達(dá)明顯高于臨床緩解期患兒，提示miR-138 可能參與BA 發(fā)生發(fā)展。

Th 因具有抑制T 淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答功能，在BA發(fā)病機(jī)制中處于核心位置[4]。前體Th0 細(xì)胞可分化為T(mén)h1 與Th2，其中Th1 能分泌IL-2、IL-12、IFN-γ、腫瘤壞死因子-β 等細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫；Th2 能分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13 等細(xì)胞，參與體液免疫[19]。Th1 分泌的IFN-γ 能抑制Th2 功能和分化，Th2 分泌的IL-4 能抑制Th1 功能和分化。因此，生理狀態(tài)下Th1 和Th2 的功能和細(xì)胞數(shù)量是穩(wěn)定的，以確保兩者平衡，若Th1/Th2 失衡，則會(huì)抑制T 淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，觸發(fā)炎癥反應(yīng)[20-22]。本研究結(jié)果顯示，BA 患兒外周血Th1 百分比、Th1/Th2 明顯低于對(duì)照組，Th2 百分比明顯高于對(duì)照組，這種差異在急性發(fā)作期患兒和臨床緩解期患兒中仍然存在，提示BA 患兒的Th1/Th2 平衡明顯失調(diào)，向Th2 方向偏移。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期組外周血Th1 相關(guān)抗炎細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ）水平明顯低于臨床緩解期組、對(duì)照組，Th2 相關(guān)促炎細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）水平明顯高于臨床緩解期組、對(duì)照組，提示Th1/Th2 失衡可能導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，符合既往研究報(bào)道[4]。強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-138 與Th1/Th2 呈負(fù)相關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，BA 患兒外周血miR-138 與Th1/Th2 呈負(fù)相關(guān)，提示miR-138 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡介導(dǎo)BA 炎癥反應(yīng)進(jìn)展。BA 患兒外周血miR-138 與IL-2、IFN-γ 呈負(fù)相關(guān)，與IL-4、IL-10 呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)miR-138 通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡介導(dǎo)BA 炎癥反應(yīng)進(jìn)展。T-bet 與GATA3 是一種轉(zhuǎn)錄因子，能選擇性表達(dá)于Th1 與Th2，決定Th0 的分化方向[24-25]。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期組外周血T-bet 水平明顯低于臨床緩解期組、對(duì)照組，GATA3 水平明顯高于臨床緩解期組、對(duì)照組；臨床緩解期組外周血T-bet 水平明顯低于對(duì)照組，GATA3 水平高于對(duì)照組。符合本研究中BA 患兒Th1、Th2 變化趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，BA 患兒外周血miR-138 與T-bet 水平呈負(fù)相關(guān)，與GATA3水平呈正相關(guān)，提示miR-138 可能通過(guò)調(diào)控T-bet、GATA3 影響Th1/Th2 平衡。

綜上所述，BA 患兒外周血miR-138 表達(dá)顯著上調(diào)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與BA 發(fā)生發(fā)展。但本研究樣本量較少，同時(shí)關(guān)于miR-138 與Th1/Th2 的具體調(diào)控機(jī)制還需體外細(xì)胞研究驗(yàn)證。