古彩茹，劉威，林夢園

1.廣州市紅十字會醫(yī)院&暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510220；2.廣州市紅十字會醫(yī)院&暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院乳腺科，廣東 廣州 510220；3.深圳市人民醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518020

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在女性癌癥患者中的發(fā)病率和死亡率均占第四位[1]。盡管早期篩查可降低宮頸癌患者的死亡率，但宮頸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移仍然是死亡的主要原因[2]，也是影響患者生存率的主要因素[3]。針對這種惡性腫瘤，目前仍需更多分子標(biāo)記物用于精準(zhǔn)診斷和預(yù)后判斷。因此，尋找宮頸癌早期診斷及預(yù)后判定新的生物標(biāo)志物具有重要的臨床價值。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases 4，PFKFB4)與癌細(xì)胞的代謝異常密切相關(guān)。有報道稱，雙功能酶PFKFB4在多種類型的癌癥中高度表達(dá)，并且在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中已證明其對腫瘤存活的重要作用[4-8]。但目前關(guān)于PFKFB4蛋白與宮頸癌的相關(guān)報道較少。本文選取PFKFB4基因作為研究目標(biāo)，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫全面分析PFKFB4基因在宮頸癌中的表達(dá)和相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究PFKFB4在宮頸癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Linked Omics分析 Linked Omics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/login.php)是一個基于網(wǎng)頁的平臺，可用于分析32個與TCGA癌癥相關(guān)的多維數(shù)據(jù)集[9]。本研究通過Linked Omics研究TCGA數(shù)據(jù)庫宮頸癌組織中的PFKFB4表達(dá)與患者腫瘤大小(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M分期)、年齡、種族和預(yù)后(總生存，overall survival，OS)等臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。利用Link Finder模塊分析TCGA數(shù)據(jù)庫宮頸癌隊列中與PFKFB4相關(guān)的差異表達(dá)基因，根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)分析在宮頸癌中與PFKFB4顯著表達(dá)相關(guān)的基因，結(jié)果以火山圖和熱圖顯示。利用Link Finder模塊Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)對差異相關(guān)基因進(jìn)行GO[細(xì)胞成分(cellular component，CC)，生物過程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)]分析，KEGG信號通路分析激酶靶標(biāo)富集，miRNA靶標(biāo)富集和轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)富集。

1.2 c-BioPortal分析 cBioPortal是一種開放獲取的網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)資源，可用于多種癌癥的基因組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合性探索，可用于探索基因的突變，拷貝數(shù)變異(CNV)和mRNA表達(dá)情況[10]。本研究使用c-Bio-Portal分析TCGA數(shù)據(jù)庫中275例宮頸癌標(biāo)本的PFKFB4基因變異頻率和類型。

1.3 Gene MANIA分析 Gene MANIA在線數(shù)據(jù)庫(http://www.genemania.org)是一個可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)的網(wǎng)絡(luò)平臺，該平臺可以根據(jù)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行識別和擴展指定基因功能相似的基因列表[11]。Gene MANIA還可以根據(jù)每個所選查詢數(shù)據(jù)集的預(yù)測值進(jìn)行權(quán)重評估。本研究采用Gene MANIA平臺探討PFKFB4可能存在相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌中PFKFB4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果顯示，PFKFB4的表達(dá)與宮頸癌的T分期、N分期和M分期顯著相關(guān)(圖1)。T期高(P<0.001)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1)(P=0.042)、伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)(P=0.047)者PFKFB4表達(dá)量高(圖1A~1C)。PFKFB4在西班牙裔人群的宮頸癌組織中表達(dá)量顯著高于非西班牙裔人群(P=0.047)，見圖1D。PFKFB4在宮頸癌中的表達(dá)量還隨著年齡的增高而逐漸增高(r=0.199，P<0.001)，見圖1E。最后，PFKFB4的表達(dá)水平顯著影響患者的OS，PFKFB4高表達(dá)組患者的中位生存時間為137.9個月，而低表達(dá)組的中位生存時間為110.3個月，PFKFB4高表達(dá)者的預(yù)后顯著差于低表達(dá)患者(P=0.002)，見圖1F。

圖1 在宮頸癌中PFKFB4的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

2.2 宮頸癌中PFKFB4的相關(guān)性表達(dá) 為明確PFKFB4的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過Person相關(guān)性分析探討與PFKFB4表達(dá)顯著相關(guān)的基因(圖1A)，結(jié)果提示PPFIA4、PDK1、P4HA1、SLC2A1、VEGFA是呈正相關(guān)差異最明顯的前5個基因(圖2B)，而SELP、ISCU、PLA1A、PGR和ALDH1A2是呈負(fù)相關(guān)差異最顯著的前5個基因(圖2C)。

圖2 在宮頸癌中與PFKFB4相關(guān)的差異表達(dá)基因(Linked Omics)

2.3 宮頸癌中與PFKFB4表達(dá)相關(guān)的激酶、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò) 為進(jìn)一步探索PFKFB4中PFKFB4的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)多個與PFKFB4統(tǒng)計學(xué)相關(guān)的激酶、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子。與PFKFB4表達(dá)相關(guān)最顯著的前五個激酶分別是淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶LCK(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)、蛋白激酶N2(PKN2)、檢查點蛋白激酶1(CHEK1)、激酶IJK和激酶MA2PK1。與PFKFB4表達(dá)相關(guān)最顯著的前五個miRNA分別是miR-200a、miR-450、miR-18a、miR-423和miR-383。與PFKFB4相關(guān)最顯著的前五個轉(zhuǎn)錄因子分別是HIF1、NFE2、ROAZ、AP1和MYOGNF1，見表1。

表1 宮頸癌中的激酶、miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子靶向網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能注釋和KEGG信號通路分析 在Linked Omics數(shù)據(jù)分析平臺，對PFKFB4及其在宮頸癌中顯著表達(dá)的相關(guān)基因進(jìn)行基因富集分析(GESA)，其富集的生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、水解酶活動、轉(zhuǎn)移酶活動等(圖3A)。通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，PFKFB4及顯著相關(guān)基因在宮頸癌中主要參與了缺氧誘導(dǎo)因子HIF1信號通路，糖酵解/糖再生信號通路，果糖和甘露糖代謝通路等(圖3B)。

2.5 宮頸癌中PFKFB4的基因組改變 通過cBioPortal分析TCGA數(shù)據(jù)庫中275例宮頸癌的突變頻率和類型，結(jié)果顯示275名宮頸癌患者中只有1.8%的患者的PFKFB4發(fā)生了改變(圖4)。這些改變包括：mRNA上調(diào)4例(1.45%)和突變1例(0.36%)。由此可見，在宮頸癌中，PFKFB4的基因突變發(fā)生率非常低。

2.6 PFKFB4的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 通過Gene-MANIA分析PFKFB4的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示PFKFB4與低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1A)，己糖激酶2(HK2)，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶1/2/3(PFKFB1/2/3)，磷酸甘油酸變位酶1/2/4/5，賴氨酸羥化酶1(PLOD1)，線粒體融合蛋白(MFN1)等存在相互作用(圖5)。

圖5 PFKFB4的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和功能分析

3 討論

宮頸癌的治療主要以手術(shù)、化療和放療為主，但是上述治療之后仍存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移可能。目前，臨床上迫切需要開發(fā)更多分子標(biāo)記物用于宮頸癌的精準(zhǔn)診斷和預(yù)后判斷。癌細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下仍然通過糖酵解來代謝葡萄糖為其供能，靶向腫瘤的糖酵解被認(rèn)為是一個潛在的治療策略[12-13]。雙功能酶PFKFB4是一個糖酵解的關(guān)鍵酶，大量研究提示PFKFB4與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[5，8，14-16]。但是，PFKFB4在宮頸癌中是否能作為預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物尚不清楚。為了更深入地了解PFKFB4在宮頸癌中診斷和預(yù)后判斷方面的價值，通過對公共測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究PFKFB4的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并探討PFKFB4在宮頸癌中的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這項研究為PFKFB4在宮頸癌進(jìn)展中的重要性及其作為宮頸癌潛在預(yù)后標(biāo)志物提供了多層次的證據(jù)。研究結(jié)果表明PFKFB4的過表達(dá)對宮頸癌的生長侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者生存結(jié)局中具有顯著的影響。PFKFB4在宮頸癌中與幾種腫瘤相關(guān)激酶(例如MK2PK1)、miRNA(例如miRNA-200a)和轉(zhuǎn)錄因子(例如HIF1)顯著相關(guān)。這項研究基于生物信息學(xué)挖掘公共數(shù)據(jù)庫中的宮頸癌測序數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究PFKFB4在宮頸癌中的功能和機制奠定了初步基礎(chǔ)。

本研究首先對PFKFB4在宮頸癌組織中表達(dá)與患者臨床的病理特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)PFKFB4的表達(dá)與患者更晚的TNM分期密切相關(guān)。PFKFB4在腫瘤越大的患者中表達(dá)量明顯高于腫瘤較小的患者，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者組織中的表達(dá)也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，這就提示PFKFB4與宮頸癌更具有侵襲性的臨床病理特征是明確相關(guān)的，PFKFB4很有可能促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展。其次，PFKFB4的表達(dá)與患者的年齡相關(guān)，隨著患者的年齡增長，PFKFB4的表達(dá)量也有升高趨勢。另外，生存分析進(jìn)一步明確PFKFB4的表達(dá)與患者的OS的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFKFB4高表達(dá)的患者預(yù)后顯著差于低表達(dá)的患者。這就表明PFKFB4可以作為宮頸癌的預(yù)后標(biāo)記物，但是，仍需要多中心的研究進(jìn)一步證實。

考慮到PFKFB4與患者預(yù)后的顯著相關(guān)性，PFKFB4可能對宮頸癌的惡性進(jìn)展發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究進(jìn)一步探討與PFKFB4在表達(dá)上存在統(tǒng)計學(xué)相關(guān)的基因。相關(guān)性分析提示PFKFB4與一些癌基因的表達(dá)呈正相關(guān)，比如影響癌癥的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)[17-18]，參與腫瘤血管形成促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)[19-20]，多種腫瘤的潛在標(biāo)記物和治療靶點脯氨酸-4-羥化酶α多肽Ⅰ(P4HA1)[21-22]等。這些結(jié)果進(jìn)一步提示PFKFB4可能通過與其他癌基因相互作用共同促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展。

本研究使用GSEA對PFKFB4進(jìn)行富集分析獲得了與其存在顯著關(guān)聯(lián)的多個激酶，miRNA和轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明，PFKFB4的功能網(wǎng)絡(luò)主要參與代謝、生物調(diào)節(jié)、對刺激的反應(yīng)和細(xì)胞增殖等。發(fā)現(xiàn)宮頸癌中的PFKFB4與包括MAP2K1、CHEK1和LCK在內(nèi)的激酶網(wǎng)絡(luò)相關(guān)。這些激酶可參與調(diào)節(jié)有絲分裂、DNA損傷和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，這些通路異常與腫瘤的進(jìn)展關(guān)系非常密切。此外，本研究還鑒定了幾種與PFKFB4相關(guān)的miRNA。這些小RNA，可參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展。亦有其他研究證實miR-200a、miR-18a和miR-383可用作宮頸癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[23-25]。

這項研究使用基于生物信息學(xué)的在線工具對來自TCGA數(shù)據(jù)庫的宮頸癌的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行靶基因分析，揭示了PFKFB4的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息，為進(jìn)一步研究PFKFB4在宮頸癌中的作用奠定基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的芯片篩選相比，該方法具有樣本量大、成本低、操作簡便的優(yōu)點。這也使得大規(guī)模的宮頸癌的基因組學(xué)研究和后續(xù)功能研究成為可能。但是，本研究基于數(shù)據(jù)挖掘的分析結(jié)果仍需要得到更多的檢測進(jìn)行驗證，包括功能檢測和分子機制的研究，才能進(jìn)一步明確PFKFB4在宮頸癌的調(diào)控作用。