陳炯華 方 雪 白茹雪 白 羽 嚴(yán)展鵬 李壯壯 周 影

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210023；3.山東力明科技職業(yè)學(xué)院，山東泰安271099）

偏頭痛是一種由神經(jīng)血管功能紊亂引起的頭痛，部位多位于單側(cè)，頭痛呈搏動(dòng)樣，活動(dòng)后頭痛可加重，可伴隨惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀[1]。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，偏頭痛年患病率達(dá)9.3%，女性發(fā)病率是男性的3倍[2]。近年來(lái)，偏頭痛在兒童及青少年中的患病率呈逐年上升趨勢(shì)，已經(jīng)變成影響兒童及青少年健康的主要問(wèn)題之一[3]。西醫(yī)治療主要包括發(fā)作期用藥（非甾體抗炎藥、阿片類藥、麥角類藥、曲普坦類藥、CGRP受體拮抗劑）、預(yù)防性用藥（鈣離子阻滯劑、抗癲癇藥、β受體阻滯劑、抗抑郁藥等），僅能臨時(shí)緩解癥狀，且長(zhǎng)期服用有神經(jīng)系統(tǒng)損害、抑郁、嗜睡、認(rèn)知異常、肝腎功能損害、高血壓或低血壓、胃腸道反應(yīng)等副作用。中醫(yī)對(duì)偏頭痛的認(rèn)識(shí)歷史悠久，治療方法多樣，臨床療效顯著。芎芷鎮(zhèn)痛方是江蘇省名老中醫(yī)符為民教授治療瘀血阻絡(luò)型偏頭痛的經(jīng)驗(yàn)方，具有祛風(fēng)通絡(luò)、化瘀止痛之效，治療偏頭痛療效顯著，但其作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)觀察了芎芷鎮(zhèn)痛方對(duì)偏頭痛模型大鼠撓頭次數(shù)及大腦三叉神經(jīng)節(jié)瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）表達(dá)的影響，從而探討芎芷鎮(zhèn)痛方治療偏頭痛的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體重200～250 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，自由飲水和進(jìn)食，光照條件為明暗各12 h，SPF級(jí)飼養(yǎng)室溫度應(yīng)保持在20～25 ℃。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作流程均符合動(dòng)物倫理要求，由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理辦公室審查，倫理批準(zhǔn)編號(hào)：AEWC-20200519-108。

1.2 主要藥物 中藥材（川芎、白芷、當(dāng)歸、僵蠶、全蝎、地龍）購(gòu)自江蘇省中西結(jié)合醫(yī)院藥劑科；硝酸甘油注射液（批號(hào)：20200310），1 mL∶5 mg，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020289；鹽酸氟桂利嗪膠囊（批號(hào)：JLJORAU），西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10930003。

1.3 主要試劑 兔抗鼠TRPV1抗體（批號(hào)：bs-23927R），購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗-HRP（批號(hào)：KIT-9710）和DAB顯色試劑盒（批號(hào)：DAB-2032），購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；二甲苯（批號(hào)：1604012）、乙醇（批號(hào)：10009257）、封片劑（批號(hào)：10004160），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；PBS磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：ZLI-9062），購(gòu)自北京中杉金橋公司；抗原修復(fù)液（批號(hào)：P0081）、封閉液（批號(hào)：P0260），購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。1.4 主要儀器 顯微照相系統(tǒng)（型號(hào)：CK31），購(gòu)自日本Olymus公司；-80 ℃低溫冰箱（型號(hào)：HFU-486），購(gòu)自美國(guó)thermo公司；脫水機(jī)（型號(hào)：CJ-12P1）、包埋機(jī)（型號(hào)：CB-8D），購(gòu)自湖北定源醫(yī)療設(shè)備有限公司；切片機(jī)（型號(hào)：RM2245），購(gòu)自德國(guó)leica公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 芎芷鎮(zhèn)痛方制備 芎芷鎮(zhèn)痛方由川芎10 g、白芷10 g、當(dāng)歸12 g、僵蠶10 g、全蝎5 g、地龍5 g共6味中藥組成，用水提的方法提取實(shí)驗(yàn)用藥液，第1次加藥材10倍量的水提取2 h，過(guò)濾，藥渣加5倍量的水提取1.5 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，得芎芷鎮(zhèn)痛方水提液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組與給藥 SD大鼠60只，雄性，隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、氟桂利嗪組（0.45 mg/kg）和芎芷鎮(zhèn)痛方低（4.69 g/kg）、中（9.38 g/kg）、高（18.76 g/kg）劑量組。各組均連續(xù)灌胃給藥或等體積生理鹽水7 d，均每日灌胃1次。

2.3 造模 除空白組外，其余各組大鼠末次灌胃0.5 h后，采用頸部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油注射液的方法制備偏頭痛大鼠模型[4]。造模后，大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增加、前肢頻繁撓頭、往返運(yùn)動(dòng)等煩躁不安表現(xiàn)，表明造模成功[5]。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 撓頭次數(shù) 從造模成功起，記 錄0～30 min、30～60 min、60～90 min、90～120 min 4個(gè)時(shí)間段大鼠撓頭次數(shù)。

2.4.2 三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1表達(dá) 造模成功4 h后，各組大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，剪刀剪開(kāi)顱頂，剔除顱骨及大腦組織，顯示三叉神經(jīng)節(jié)，剝離三叉神經(jīng)節(jié)表面的硬腦膜，分離出三叉神經(jīng)節(jié)，再將三叉神經(jīng)節(jié)放入甲醛固定液中保存。將固定的三叉神經(jīng)節(jié)依次脫水、透明、浸蠟、包埋，切片、攤片，放入載玻片，再將切片放入60 ℃烘干機(jī)中烘干1 h。切片脫蠟，水化，抗原修復(fù)，用蒸餾水清洗切片3次，5 min/次，擦干切片，用免疫組化筆化圈，再滴入50 μL過(guò)氧化氫，孵育10 min；用蒸餾水清洗切片2次，5 min/次，PBST溶液清洗切片5 min；于每個(gè)切片上滴入400 μL封閉液，室溫下封閉1 h；清除封閉液，每個(gè)切片滴加一抗50 μL，4 ℃孵育過(guò)夜；拿出切片恢復(fù)至室溫，清除一抗，PBST溶液清洗切片3次，5 min；每個(gè)切片加入二抗50 μL，室溫下孵育1 h；PBST溶液清洗切片3次，5 min/次；每個(gè)切片加入100 μL DAB，顯色后沖洗，滴加蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗3 min，分化，反藍(lán)，鏡檢，蒸餾水中清洗2次（5 min/次），脫水，蓋玻片、中性樹(shù)膠封片。光鏡下細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色即為有蛋白表達(dá)。在光鏡100倍視野下，用顯微鏡對(duì)每張切片的蛋白表達(dá)區(qū)域進(jìn)行拍照，每張切片選3個(gè)視野。用Image-Pro Plus軟件計(jì)算出每張照片中TRPV1的平均光密度值，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x-±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較使用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠造模后各時(shí)間段撓頭次數(shù)比較 結(jié)果見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組、氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）；在30～60 min、60～90 min、90～120 min時(shí)間段，芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠撓頭次數(shù)均明顯低于氟桂利嗪組（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠造模后各時(shí)間段撓頭次數(shù)比較（x-±s） 單位：次

3.2 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖1?？瞻捉M大鼠三叉神經(jīng)節(jié)少數(shù)細(xì)胞質(zhì)染色呈淺棕色，大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)未染色。模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TRPV1表達(dá)明顯增強(qiáng)，大部分細(xì)胞質(zhì)染色呈深棕色。氟桂利嗪組多數(shù)細(xì)胞質(zhì)染色呈淺棕色；芎芷鎮(zhèn)痛方低劑量組可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞質(zhì)染色呈深棕色；芎芷鎮(zhèn)痛方中劑量組可見(jiàn)部分細(xì)胞質(zhì)染色呈淺棕色；芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量組可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞質(zhì)染色呈淺棕色。

與空白組比較，模型組、氟桂利嗪組、芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠TRPV1平均光密度值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠TRPV1平均光密度值明顯減少（P＜0.05）；與氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方低、中劑量組比較，芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量組TRPV1平均光密度值明顯減少（P＜0.05）；芎芷鎮(zhèn)痛方低、中劑量組大鼠TRPV1平均光密度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1免疫組化染色結(jié)果（×100）

表2 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1平均光密度值比較（x-±s）

4 討論

偏頭痛是神經(jīng)內(nèi)科臨床常見(jiàn)疾病，其具體發(fā)病機(jī)制至今尚未清晰，但三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)是目前解釋偏頭痛發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說(shuō)，近年來(lái)廣受重視。鹽酸氟桂利嗪膠囊能緩解血管痙攣，對(duì)血管收縮物質(zhì)引起的持續(xù)性血管痙攣有持久的抑制作用，尤其對(duì)基底動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈效果更為明顯，并有前庭抑制作用，能增加耳蝸小動(dòng)脈血流量，改善前庭器官血液循環(huán)，從而緩解偏頭痛。

新近研究表明，TRPV1又稱為辣椒素受體，分布于傷害性感受器上，且TRPV1與疼痛密切相關(guān)。TRPV1是一種存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上的非選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)Ca2+具有高通透性[6]，屬于瞬時(shí)感受器電位通道（transient receptor potential channels，TRPs）家族成員亞型之一。內(nèi)源性或外源性傷害性刺激通過(guò)興奮三叉神經(jīng)感覺(jué)纖維上的TRPV1信號(hào)通路，引起Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而導(dǎo)致三叉神經(jīng)感覺(jué)纖維末梢釋放降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）、P物質(zhì)（substance P，SP）、神經(jīng)激肽A（neurokinin A，NKA）等神經(jīng)遞質(zhì)，引起無(wú)菌性神經(jīng)源性炎癥，繼而產(chǎn)生偏頭痛。TRP通道最早在果蠅的視覺(jué)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，因突變體果蠅對(duì)持續(xù)的光刺激只產(chǎn)生瞬時(shí)鋒電位而命名[7]。在哺乳動(dòng)物中，TRPs包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML及TRPN七個(gè)亞家族[8]。上述7個(gè)亞家族又分別包括不同的亞型，其中TRPV家族成員包括6個(gè)亞型：TRPV1-V6[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1、TRPM8表達(dá)于疼痛感受器中，與疼痛相關(guān)[10]。1997年，CATERINA M J等[11]首次在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中克隆出TRPV1。TRPV1主要表達(dá)于三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、淋巴結(jié)神經(jīng)節(jié)的中、小型傷害感受器神經(jīng)元中[12]。TRPV1在炎性痛、神經(jīng)痛、癌性痛等疼痛疾病中發(fā)揮重要作用。TRPV1可被內(nèi)源性或外源性刺激激活，內(nèi)源性激活劑包括酸（pH＜5.9）、熱刺激（＞43 ℃）、一氧化氮（NO）、Ca2+、Mg2+、花生四烯酸及其代謝物等，外源性激活劑包括辣椒素及其類似物、大蒜素、大麻素樣物質(zhì)、吳茱萸堿等。TRPV1被激活后，細(xì)胞外大量Ca2+流入胞內(nèi)，伴有少量的K+、Na+、Mg2+等內(nèi)流，導(dǎo)致動(dòng)作電位產(chǎn)生并誘發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，繼而引發(fā)疼痛。YOSHIDA T等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NO可通過(guò)S-硝基化半胱氨酸途徑進(jìn)一步激活TRPV1。隨著對(duì)TRPV1的深入研究，研究者研發(fā)相關(guān)藥物以阻斷TRPV1離子通道為靶點(diǎn)，達(dá)到緩解疼痛的目的，TRPV1拮抗劑如氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）、釕紅（ruthenium red，RR）、碘化樹(shù)膠脂毒素（I-RTX）[14]，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但其多存在引起體溫過(guò)高等不良反應(yīng)。

偏頭痛可歸屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”“首風(fēng)”“頭風(fēng)”“腦風(fēng)”“厥逆頭痛”“偏頭風(fēng)”等范疇。符為民教授認(rèn)為，偏頭痛病理因素雖與風(fēng)、火、痰、瘀、虛有關(guān)，但偏頭痛患者病程較長(zhǎng)，纏綿難愈，久病入絡(luò)，久病必瘀，各種致病因素均可導(dǎo)致脈絡(luò)阻滯不通，產(chǎn)生瘀血，而瘀血的產(chǎn)生則進(jìn)一步加重頭痛的程度。此外，許多偏頭痛患者合并有緊張、焦慮、抑郁等狀態(tài)，致使肝郁氣滯，久則導(dǎo)致氣血運(yùn)行障礙，脈絡(luò)不通，產(chǎn)生瘀血。因此，符老指出瘀血阻絡(luò)是偏頭痛的主要病機(jī)，且貫穿于疾病始終，并自擬芎芷鎮(zhèn)痛方治療本病。方中川芎行氣解郁、祛風(fēng)除濕、化瘀止痛；白芷祛風(fēng)燥濕、消腫、止痛；當(dāng)歸補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)止痛；僵蠶化痰散結(jié)、息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛；全蝎息風(fēng)止痙、通絡(luò)止痛、散結(jié)攻毒；地龍清熱息風(fēng)、活血通絡(luò)。臨床發(fā)現(xiàn)此方可降低偏頭痛發(fā)作頻率、持續(xù)時(shí)間，并可降低遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率，療效顯著[15]?，F(xiàn)代藥理研究表明，川芎和當(dāng)歸的主要成分阿魏酸，白芷的主要成分歐前胡素，均具有抗炎癥和抗氧化的作用[16-17]。草酸銨是僵蠶的主要成分，具有抗凝血的作用[18]。蝎毒是全蝎的毒性物質(zhì)機(jī)制，主要包含透明質(zhì)酸酶等，具有鎮(zhèn)痛和溶栓的作用[19]。地龍的主要成分有多肽和微量元素，地龍的醇提取物可以發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用[20]。這些研究說(shuō)明芎芷鎮(zhèn)痛方的藥效發(fā)揮與抑制機(jī)體炎癥發(fā)生密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，模型組、氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組在造模成功后即出現(xiàn)前肢頻繁撓頭現(xiàn)象，說(shuō)明硝酸甘油可引發(fā)偏頭痛，引起大鼠撓頭次數(shù)增加，且在30～60 min內(nèi)撓頭次數(shù)達(dá)最高值，60 min后各組大鼠撓頭次數(shù)逐漸減少。鹽酸氟桂利嗪膠囊和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量對(duì)偏頭痛大鼠的行為學(xué)癥狀均有改善作用，其中芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量的改善作用優(yōu)于鹽酸氟桂利嗪膠囊，且以芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量改善作用最佳。

造模大鼠三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1表達(dá)均明顯高于空白組，說(shuō)明硝酸甘油可增加TRPV1表達(dá)，產(chǎn)生偏頭痛。各給藥組大鼠TRPV1表達(dá)較模型組顯著減少，提示芎芷鎮(zhèn)痛方與鹽酸氟桂利嗪膠囊可通過(guò)抑制偏頭痛模型大鼠三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1的表達(dá)，從而治療偏頭痛，其中芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量組TRPV1表達(dá)最低，提示芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量抑制TRPV1表達(dá)的作用最優(yōu)。

綜上，芎芷鎮(zhèn)痛方能顯著減少偏頭痛模型大鼠撓頭次數(shù)，改善大鼠的行為學(xué)癥狀，降低大鼠三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1的表達(dá)，提示芎芷鎮(zhèn)痛方可能是通過(guò)抑制三叉神經(jīng)節(jié)TRPV1的表達(dá)，從而治療偏頭痛。在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可以從抗神經(jīng)炎癥方面研究芎芷鎮(zhèn)痛方對(duì)偏頭痛模型動(dòng)物客觀指標(biāo)的改善作用，利用質(zhì)譜組學(xué)技術(shù)研究芎芷鎮(zhèn)痛方的主要成分和物質(zhì)基礎(chǔ)，深入探討并明確芎芷鎮(zhèn)痛方治療偏頭痛的作用機(jī)制，進(jìn)而為芎芷鎮(zhèn)痛方的臨床推廣使用提供客觀的科學(xué)依據(jù)。