楊兆艷，張 玲，田艷花，王玲麗

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系，山西 太原 030031；2.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000）

目前，機(jī)體免疫功能下降已成為危害現(xiàn)代人類健康的一大隱患，由于缺乏針對性的治療措施，依靠日常飲食調(diào)理是提高人體免疫能力的最理想方法之一[1]。鑒于免疫功能低下人群的日益龐大，以及目前缺乏以傳統(tǒng)食品為載體的免疫調(diào)節(jié)保健品，開發(fā)一款具有增強(qiáng)免疫力功效的保健食品具有較高的現(xiàn)實(shí)意義和推廣價(jià)值。

紅棗和山藥都是集藥、食、補(bǔ)三大功能于一體的保健佳品，具有健脾、養(yǎng)胃、益氣的作用。紅棗及紅棗提取物對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)均有一定的作用[2-6]；山藥多糖在一定程度上能夠改善小鼠免疫功能[7-9]；藍(lán)莓提取物在一定程度上能夠增強(qiáng)小鼠免疫力[10]。目前，能充分突出紅棗特色營養(yǎng)品質(zhì)和依靠現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)開發(fā)的深加工產(chǎn)品很少[11-13]，山藥也主要為餐桌食品[14-16]。咀嚼片作為一種新型食品的形式，具有攜帶、食用、保存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，且可以根據(jù)消費(fèi)者不同的喜好和產(chǎn)品本身的要求制成形狀各異、外表美觀的片劑，增強(qiáng)消費(fèi)者對產(chǎn)品的興趣[17-21]。本試驗(yàn)以山西臨縣黃河灘棗和平遙長山藥為研究對象，開發(fā)一款攜帶和食用方便的咀嚼片，通過動(dòng)物受試試驗(yàn)評價(jià)其免疫調(diào)節(jié)活性，以期為紅棗、山藥、藍(lán)莓的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

1.1.1.1 咀嚼片原輔料

紅棗：山西臨縣黃河灘棗；山藥：平遙長山藥；藍(lán)莓果粉：市售；木糖醇、微晶纖維素、檸檬酸，均為食品級。

1.1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級昆明種小鼠，雄性，4周齡左右，體質(zhì)量18～22 g，小鼠飼養(yǎng)溫度為20～26℃，相對濕度40%～60%，每天照明12 h，自由飲水，飼喂無菌全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料。

1.1.1.3 藥品與試劑

綿羊紅細(xì)胞（SRBC），北京博爾西科技有限公司；刀豆蛋白A（ConaA）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，賽默飛世爾科技公司；印度墨汁，南京都萊生物技術(shù)有限公司；YAC-1細(xì)胞，上?？道噬锟萍加邢薰荆恍∨Ｑ?，上海士峰生物科技有限公司；Hank’s液，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

405型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，泰州金馳電力設(shè)備有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器有限公司；DFY-300粉碎機(jī)，北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司；ZP01型單沖壓片機(jī)，泰州市黎明制藥機(jī)械有限公司；T9CS型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-4恒溫水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；TG16-WS離心機(jī)，湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LHH.CP-100 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海印溪儀器儀表有限公司；NYW-MB96酶標(biāo)儀，北京諾亞威儀器儀表有限公司；TA-XTC質(zhì)構(gòu)儀，上海保圣實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 紅棗粉的制備

選取新鮮、無腐爛的紅棗，切成6 mm薄片，于60℃烘箱中烘干16 h，干燥器內(nèi)冷卻，粉碎后過140目篩。

1.2.2.2 山藥粉的制備

選取新鮮、無腐爛的山藥，切成4 mm薄片，在復(fù)合護(hù)色劑中浸泡15 min，用清水沖洗干凈后于60℃干燥箱中干燥8 h，干燥器內(nèi)冷卻，粉碎后過140目篩[16]。

1.2.2.3 制片

參照文獻(xiàn)[17-20]的方法，結(jié)合產(chǎn)品自身特性，確定制片工藝為：向已配好的混合料中緩慢噴灑純凈水，攪拌均勻，制成具有一定軟度的軟料，軟料要求捏成團(tuán)，觸之即散；軟料制成后選用14目篩作為制粒工具，將軟料過篩制成大小均勻的顆粒；將濕顆粒在50℃烘箱內(nèi)干燥30 min至水分含量小于3%；過20目篩整粒，再使用80目篩去除細(xì)粉；在整粒后的顆粒中加入質(zhì)量比為0.5%的硬脂酸鎂，使用單沖壓片機(jī)進(jìn)行壓片；壓片后放入無菌室紫外線滅菌30 min，密封包裝。

1.2.3 感官評價(jià)

產(chǎn)品感官評價(jià)由食品專業(yè)的老師和學(xué)生共計(jì)15人完成，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 咀嚼片感官評價(jià)表Table 1 Sensory evaluation table of chewable tablets

1.2.4 基礎(chǔ)配方的確定

參照GB 2760—2014[21]規(guī)定的內(nèi)容，結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以紅棗、山藥和藍(lán)莓果粉為主料，輔以微晶纖維素、木糖醇和檸檬酸，得到基礎(chǔ)配方為：紅棗粉7 g，山藥粉3 g，藍(lán)莓果粉10 g，微晶纖維素4 g，木糖醇0.3 g，檸檬酸0.08 g。

文中藍(lán)莓果粉、微晶纖維素、木糖醇、檸檬酸添加量以每10 g紅棗山藥粉為基準(zhǔn)。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 紅棗粉、山藥粉添加比例的篩選

以“1.2.4”的配方為基礎(chǔ)，紅棗粉與山藥粉總添加量固定為10 g，配方中其他成分的添加量不變，考察紅棗粉和山藥粉質(zhì)量比分別為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1時(shí)對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官評價(jià)的影響，確定紅棗粉和山藥粉的添加比例。

1.2.5.2 藍(lán)莓果粉添加量的篩選

以“1.2.4”的配方為基礎(chǔ)，固定紅棗粉和山藥粉添加質(zhì)量比為2.5∶1（總量為10 g），微晶纖維素添加量4 g，木糖醇添加量0.3 g，檸檬酸添加量0.08 g，考察藍(lán)莓果粉添加量分別為8、9、10、11、12 g時(shí)對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官評價(jià)的影響，確定咀嚼片中藍(lán)莓果粉的添加量。

1.2.5.3 微晶纖維素添加量的篩選

固定紅棗粉和山藥粉添加質(zhì)量比為2.5∶1（總量為10 g），藍(lán)莓果粉添加量10 g，木糖醇添加量0.3 g，檸檬酸添加量0.08 g，考察微晶纖維素添加量分別為2、3、4、5、6 g時(shí)對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官評價(jià)的影響，確定咀嚼片中微晶纖維素的添加量。

1.2.5.4 木糖醇添加量的篩選

固定紅棗粉和山藥粉添加質(zhì)量比為2.5∶1（總量為10 g），藍(lán)莓果粉添加量10 g，微晶纖維素添加量4 g，檸檬酸添加量0.08 g，考察木糖醇添加量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g時(shí)對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官評價(jià)的影響，確定咀嚼片中木糖醇的添加量。

1.2.5.5 檸檬酸添加量的篩選

固定紅棗粉和山藥粉添加質(zhì)量比為2.5∶1（總量為10 g），藍(lán)莓果粉添加量10 g，微晶纖維素添加量4 g，木糖醇添加量0.3 g，考察檸檬酸添加量分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g時(shí)對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官評價(jià)的影響，確定咀嚼片中檸檬酸的添加量。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以紅棗粉和山藥粉添加質(zhì)量比（紅棗山藥粉總質(zhì)量為10 g）及藍(lán)莓果粉、微晶纖維素、木糖醇、檸檬酸添加量為自變量，以產(chǎn)品感官評分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)5因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片的配方進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.7 體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)

將160只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組共4大組，每大組40只，組內(nèi)再分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4小組，每小組10只動(dòng)物，具體試驗(yàn)項(xiàng)目分組為：Ⅰ組開展臟/體比值計(jì)算和碳廓清實(shí)驗(yàn)，Ⅱ組開展小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）和NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)（LDH法），Ⅲ組開展遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（足跖增厚法），Ⅳ組開展抗體生成細(xì)胞檢測（Jerne改良玻片法）和血清溶血素測定（半數(shù)溶血值法）。咀嚼片按人體日推薦量（10 g/60 kg）的5倍（0.833 g/kg）、10倍（1.667 g/kg）、20倍（3.333 g/kg）設(shè)置小鼠低、中、高3個(gè)劑量組，分別取樣品0.833、1.667、3.333 g，加蒸餾水至20 mL，按照20 mL/kg BW給予灌胃，每日1次，對照組給予相同體積的蒸餾水。連續(xù)灌胃30 d之后，參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[22]中的方法測試各免疫指標(biāo)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片中紅棗粉與山藥粉比例的確定

由表3可以看出，當(dāng)紅棗粉含量過低時(shí)，產(chǎn)品整體風(fēng)味較差，有中藥味，且產(chǎn)品黏合性不好，有裂縫；紅棗粉含量過高時(shí)，產(chǎn)品口感粗糙，脫模粘連嚴(yán)重，原因可能是紅棗粉中糖含量較高。因此，確定產(chǎn)品中紅棗粉與山藥粉添加質(zhì)量比為2.5∶1。

表3 紅棗粉與山藥粉不同添加比例對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of different adding proportion of jujube powder and yam powder on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.1.2 紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片中藍(lán)莓果粉添加量的確定

由表4可以看出，藍(lán)莓果粉的添加量主要影響產(chǎn)品的風(fēng)味，當(dāng)藍(lán)莓果粉添加量過低或過高時(shí)，產(chǎn)品整體風(fēng)味都較差。因此，確定產(chǎn)品中藍(lán)莓果粉的添加量為10 g。

表4 藍(lán)莓果粉添加量對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 4 Effect of blueberry powder addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.2 紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片中微晶纖維素添加量的確定

由表5可以看出，微晶纖維素的添加量主要影響產(chǎn)品的硬度，當(dāng)微晶纖維素添加量過低時(shí)，產(chǎn)品硬度差，易碎，過高時(shí)，產(chǎn)品硬度過高，咀嚼性差。因此，確定產(chǎn)品中微晶纖維素的添加量為4 g。

表5 微晶纖維素添加量對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 5 Effect of microcrystalline cellulose addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.3 紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片中木糖醇添加量的確定

由表6可以看出，木糖醇的添加量主要影響產(chǎn)品的甜度，當(dāng)木糖醇添加量過低或過高時(shí)，產(chǎn)品整體風(fēng)味都較差。因此，確定產(chǎn)品中木糖醇的添加量為0.3 g。

表6 木糖醇添加量對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 6 Effect of xylitol addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.4 紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片中檸檬酸添加量的確定

由表7可以看出，檸檬酸的添加量主要影響產(chǎn)品的酸度，當(dāng)檸檬酸添加量過低或過高時(shí)，產(chǎn)品整體風(fēng)味都較差。因此，確定產(chǎn)品中檸檬酸的添加量為0.08 g。

表7 檸檬酸添加量對紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 7 Effect of citric acid addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素及水平，將紅棗粉∶山藥粉、藍(lán)莓果粉、微晶纖維素、木糖醇和檸檬酸添加量為自變量，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以感官評分為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8。

表8中46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和0點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量，取值在由-1，0，1構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，0點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，重復(fù)試驗(yàn)6次，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表8 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Response surface central composite design and results

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果回歸分析

利用Design Expert軟件，通過響應(yīng)面回歸方程分析數(shù)據(jù)，建立感官評分的回歸模型，尋找其最優(yōu)的反應(yīng)條件。分析結(jié)果見表9和表10。

表10 模型可信度分析Table 10 Reliability analysis of model

如表9～10所示，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），校正擬合度為0.980 6，表明該模型有較好地?cái)M合性，該回歸模型可用于預(yù)測分析且能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；變異系數(shù)值越小，表明試驗(yàn)的可靠性越高；模型預(yù)測擬合度值0.967 0與校正擬合度值0.980 6相近；信噪比一般大于或等于4即可取，試驗(yàn)信噪比為37.036，表明該模型可以用于指導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。

2.5.3 交互作用分析

從圖1和表9可知，對交互項(xiàng)AC、CD的顯著性分析均為P＞0.05，交互作用不顯著，AB交互作用顯著（P＜0.05）、AD、AE、BC、BD、BE、CE、DE交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖1 各因素交互作用對產(chǎn)品感官評分影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots of effects of interaction of various factors on the product sensory score

表9 回歸模型方差分析表Table 9 ANOVA table of regression model

2.5.4 響應(yīng)面最優(yōu)條件的確定

根據(jù)參數(shù)分析得到產(chǎn)品感官評分編碼的響應(yīng)面二次回歸模型為：

經(jīng)分析，獲得最優(yōu)的試驗(yàn)條件和最優(yōu)值為：紅棗粉與山藥粉質(zhì)量比為2.46∶1（總質(zhì)量為10 g），藍(lán)莓果粉添加量9.92 g，微晶纖維素添加量3.81 g，木糖醇添加量0.32 g，檸檬酸添加量0.09 g，此條件下，預(yù)測產(chǎn)品的感官評分為46.83分?？紤]實(shí)際操作的可操作性，將條件調(diào)整為紅棗粉與山藥粉質(zhì)量比為2.5∶1（總質(zhì)量為10 g），藍(lán)莓果粉添加量10.00 g，微晶纖維素添加量3.80 g，木糖醇添加量0.30 g，檸檬酸添加量0.07 g，在此條件下生產(chǎn)產(chǎn)品并對其進(jìn)行感官評價(jià)和硬度指標(biāo)分析，感官評分為47分，與預(yù)測值接近，說明該優(yōu)化參數(shù)可行，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。以該優(yōu)化配方制出的產(chǎn)品外觀光整，組織堅(jiān)實(shí)、不松散，剖面緊密、不粘連，酸甜適中，無異味，無粗糙感，硬度適中，宜咀嚼。

2.6 產(chǎn)品體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果

由表11可知，受試組小鼠增重與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著高于對照組（P＜0.01）。

表11 小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)測定結(jié)果Table 11 Measurement results of mouse body weight and organ index

由表12可知，與對照組比較，根據(jù)“OD差值”的數(shù)據(jù)可以看出，受試中、高劑量組都可以促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，中劑量組差異顯著（P＜0.05），高劑量組差異極顯著（P＜0.01）；受試低劑量組足跖厚度略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中、高劑量組小鼠足跖厚度極顯著增加（P＜0.01）；受試低劑量組溶血空斑數(shù)顯著增加（P＜0.05），中、高劑量組溶血空斑數(shù)極顯著增加（P＜0.01）；受試低劑量組半數(shù)溶血值（HC50）略有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中、高劑量組小鼠HC50極顯著升高（P＜0.01）；受試低劑量組碳廓清吞噬指數(shù)略有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中、高劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）；受試低劑量組NK細(xì)胞活性略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中、高劑量組都可以顯著促進(jìn)NK細(xì)胞活性的提高（P＜0.05）。

表12 小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、抗體生成細(xì)胞檢測、血清溶血素檢測、碳廓清實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測定結(jié)果Table 12 Results of mouse lymphocyte transformation test,late-type allergy test,antibody-producing cell test,serum hemolysin test,carbon clearance test,and NK cell activity measurement(±s,n=10)

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3 結(jié)論

（1）紅棗山藥藍(lán)莓咀嚼片最優(yōu)配方為：紅棗粉與山藥粉質(zhì)量比為2.5∶1（總量為10 g），藍(lán)莓果粉添加量為10 g，微晶纖維素添加量為3.8 g，木糖醇添加量為0.3 g，檸檬酸添加量為0.09 g并添加0.5%的硬脂酸鎂。在此配方下生產(chǎn)的咀嚼片外觀光整，組織堅(jiān)實(shí)、不松散，剖面緊密、不粘連，酸甜適中，滋味醇厚，無異味，無粗糙感，硬度適中，宜咀嚼。

（2）根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[22]增強(qiáng)免疫力功能判定原則：在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性4個(gè)方面，任意2個(gè)方面結(jié)果陽性，可判定受試物具有增強(qiáng)免疫力功能。試驗(yàn)結(jié)果顯示，咀嚼片可以有效延緩小鼠免疫器官的自然萎縮，提高小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫，增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性，據(jù)此判定該咀嚼片具有增強(qiáng)免疫力的功能。

該研究為紅棗、山藥和藍(lán)莓的深加工及以傳統(tǒng)食品形態(tài)為載體的免疫調(diào)節(jié)保健品的開發(fā)提供了新的途徑和方法。