張豫丹，許自成，李俊領(lǐng)，段旺軍，馬曉寒，賈 瑋,*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2.四川中煙工業(yè)有限責任公司，四川 成都 610000）

綠原酸（Chlorogenic acid，CHA）又名咖啡鞣酸、咖啡單寧酸，是由咖啡酸的1位羧基與奎寧酸的3位羥基脫水縮合形成的一種多酚類物質(zhì)[1-2]，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。CHA廣泛存在于自然界中，我國的CHA資源十分豐富，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有將近70種植物來源，在金銀花、杜仲、煙草中含量較高，是一種極性有機物[3-7]。

圖1 綠原酸化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of cholorogenic acid

現(xiàn)階段，國內(nèi)外有關(guān)CHA的研究主要集中在提取方法和藥理作用兩方面。本文概述了CHA的生物活性和國內(nèi)外植物源CHA的主要提取方法，以及CHA在抑菌方面的作用和機理，以期拓展植物源CHA在果蔬保鮮和植物抑菌方面的應用。

1 綠原酸的生物活性

CHA有“植物黃金”之美譽[8]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖、護肝等多種生物活性[9-14]以及天然提取的安全性，不僅可作為營養(yǎng)保健品和食品添加劑[10-11]，還可用于開發(fā)抗癌、抗艾滋病等藥物[15]?；谄鋸V闊的市場前景和經(jīng)濟價值，CHA受到諸多研究者的關(guān)注，其生物學功能也不斷被挖掘。

1.1 抗氧化作用

CHA具有很強的自由基清除能力，能有效清除二苯基苦基肼（DPPH）自由基，因此可作為抗氧化劑被廣泛用于日用化工和生物制藥領(lǐng)域。賀金娜[16]研究發(fā)現(xiàn)，40.09μg/mL的蘋果源CHA可清除50%的DPPH自由基，并且顯著提高大豆油的氧化穩(wěn)定性，其抗氧化效果與人工合成抗氧化劑特丁基對苯二酚（TBHQ）相當，且高于VC的抗氧化效果；周麗麗[17]發(fā)現(xiàn)，CHA有助于提高大鼠體內(nèi)腸道的抗氧化能力。Wu[18]采用DPPH自由基清除法和鐵離子抗氧化能力法（FRAP）對金銀花提取物的抗氧化活性進行表征，結(jié)果表明，CHA在抗氧化活性中發(fā)揮主要作用，且抗氧化活性與CHA含量呈正相關(guān)，可以認為CHA含量越高金銀花提取物抗氧化活性也越強。Rui等[19]用CHA和殼聚糖形成的CHA-殼聚糖偶聯(lián)物在抗氧化、清除超氧陰離子自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等方面表現(xiàn)更為優(yōu)異，且能有效保護細胞免受H2O2誘導的氧化損傷，這可能是因偶聯(lián)物在水中或有機溶劑中的溶解度提高所導致。

1.2 抗腫瘤作用

CHA是植物中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，可以通過多種途徑產(chǎn)生抗腫瘤作用，如調(diào)節(jié)細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制細胞生長等，被認為是有效抗腫瘤的天然提取物。研究表明，CHA能通過降低血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，下調(diào)Notch1的配體Delta的mRNA相對表達量，阻礙Notch1信號通路傳導來調(diào)控非小細胞肺癌凋亡[20]。周佳彬等[21]發(fā)現(xiàn)CHA可誘導膠質(zhì)瘤細胞上調(diào)p53和Bax表達、下調(diào)Livin和Bcl-2表達，最終激活Caspase-3蛋白酶活性，從而促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。此外，鑒于其良好的護肝作用，CHA與抗腫瘤化療藥物聯(lián)合應用，不僅能夠減少化療藥物的肝毒性，還能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。日本學者早在1993年就指出，天然存在于植物中的CHA能夠抑制4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）誘導的舌癌，可用于舌癌的化學預防[22]。張潔瓊等[23]采用白介素13體外誘導巨噬細胞M2極化模型，檢測M2標記CD206（特異性標志物）的表達時發(fā)現(xiàn)，與單獨使用拉帕替尼相比，其與CHA聯(lián)合抑制CD206表達效果更好，證明拉帕替尼與CHA的組合能夠抑制巨噬細胞M2極化，抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

1.3 抗病毒作用

CHA是我國傳統(tǒng)中草藥中具有抗病毒活性的重要成分之一。清熱解毒藥材金銀花，一般以CHA含量作為其品質(zhì)控制標準[24]。邢娜[25]的研究表明，天然化合物CHA體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的作用較強，可能是通過直接滅活PRRSV并抑制PRRSV引起的細胞凋亡來實現(xiàn)的。CHA體外抑制腸道病毒71型（EV71）的效果也十分顯著，主要是通過干擾EV71復制早期2AmRNA的表達和蛋白翻譯進而實現(xiàn)抗病毒作用[26]。此外，CHA還可通過抑制乙型肝炎病毒（HBV）的DNA復制來抵抗HBV[27]。

1.4 降血壓、降血糖作用

CHA除了具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒的作用外，還具有降血壓、降血糖的作用[28-29]。李旭等[30]的研究表明，從杜仲葉中提取的CHA對原發(fā)性高血壓大鼠具有較強的降壓作用，其降壓效果明顯而穩(wěn)定，因此CHA作為有降壓效果的保健品成分具有廣闊的應用前景。宋越冬等[31]采用響應面法提取蕎麥葉中的CHA進行體外降糖試驗，結(jié)果表明其對α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，其半抑制濃度（IC50）為0.161 4 mg/mL，體外降糖能力較好，可作為開發(fā)降血糖藥物的原料。

2 植物綠原酸的提取方法

CHA是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑形成的一種苯丙素類物質(zhì)[32]，具有多種植物來源，主要存在于忍冬科忍冬屬（Lonicera）和菊科蒿屬（Artemisia）中，尤其在杜仲、金銀花、葵粕、咖啡中含量較高。杜仲（Eucommia ulraoides）、牛篣（Arctium lappa）和紅花煙草（Nicotiana tobacco）的葉中富含CHA，其中杜仲葉中CHA含量可達2%～5%[33-36]。忍冬（Lonicera japonica）的根、莖、葉、花中均可提取出CHA，且花蕾中的CHA含量最高[37]。目前，國內(nèi)主要從杜仲、金銀花、煙草等植物中提取CHA，而國外則更多地以咖啡作為提取CHA的原料[38-40]。綜合國內(nèi)外綠原酸的提取方法，可大致分為水提法、有機溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等（參見表1）。

表1 植物綠原酸的提取方法及提取率Table 1 Extraction methods and extraction rates of chlorogenic acid in plants

2.1 水提法

CHA為極性較大的酚酸，依據(jù)相似相溶原理，可用水作為溶劑提取CHA。Jokic＇等[43]用亞臨界水（指將水加熱至沸點以上，臨界點以下，并控制系統(tǒng)壓力使水保持為液態(tài)的水）提取煙草中的CHA，發(fā)現(xiàn)溫度過高、提取時間過長會導致CHA的分解。與此結(jié)果相一致，Jeszka-Skowron等[44]的研究表明，溫度、時間、料液比等提取條件對植物綠原酸的提取量均有顯著的影響，采用響應面（RSM）法優(yōu)化茶葉CHA的水提法后，CHA含量最高可達（6.84±0.68）μg/mL。以蒸餾水為溶劑從煙葉中提取CHA的最佳優(yōu)化方案為：提取溫度60℃，料液比1∶16（g/mL），提取時間60 min，此條件下的得率可達2.33%[45]。從經(jīng)濟效益和環(huán)境安全方面考慮，水是最理想的溶劑。Lekar等[38]也認為，相較于有機溶劑，使用亞臨界水從生咖啡豆中提取CHA的方法更為經(jīng)濟安全。但值得注意的是，水的高沸點會導致提取物中雜質(zhì)過多，造成CHA分離困難。

2.2 有機溶劑提取法

有機溶劑提取法是利用CHA易溶于有機溶劑的特性，采用甲醇、乙醇等有機溶劑進行提取的方法。研究表明，以甲醇作為溶劑可從廢咖啡渣中提取出抗氧化劑酚類化合物CHA[39]；采用30%乙醇提取4次姜科葉片后，CHA產(chǎn)量為（234±25）mg/100 g[42]；用乙酸乙酯萃取發(fā)酵植物提取物（FPE）也可獲得CHA[46]。相較于水煎煮法，乙醇回流法可顯著提高金銀花中CHA的提取率，前者僅為2.6%，而后者高達7.2%[47]。Li等[48]通過正交試驗優(yōu)化紅薯葉中CHA的提取方法，當提取工藝為酒精濃度30%，料液比1∶2（m/V），pH 5.0，萃取4次，蒸餾90 min，提取率可達3.517%，且此種提取工藝獲得的提取物與天然狀態(tài)相近，有利于進一步純化。此外，付饒等[49]研究了不同有機溶劑對廢次煙葉CHA提取率的影響，結(jié)果表明，乙醇的提取效果優(yōu)于甲醇，這可能是由于CHA含有羥基和鄰二酚基，與乙醇的極性較接近，使得CHA在乙醇中的溶解度更大。

2.3 微波輔助提取法

微波輔助萃取（MAE）主要利用微波的電磁效應和熱效應，產(chǎn)生高度局部化的溫度和壓力，使得目標化合物以更快的速度溶出，進而從各種基質(zhì)中萃取目標化合物。研究表明，采用MAE法從金銀花中提取的CHA產(chǎn)量可高達（32.52±1.31）mg/g[50]；使用MAE從忍冬花蕾中回收CHA，產(chǎn)率在5 min內(nèi)就達到了6.14%[8]。與常規(guī)的熱回流萃取等單一提取法相比，MAE從植物原料中提取CHA耗時更短，效率更高。Zhao等[51]比較了浸提法、索氏提取法和MAE對紅棗果實酚類化合物的提取條件，發(fā)現(xiàn)MAE消耗時間更短、所用溶劑更少、提取溫度更低，運用高效液相色譜法（HPLC）檢測提取物的組分，結(jié)果顯示CHA含量可達（0.65±0.08）μg/g。通過比較不同溶劑對MAE提取率的影響，發(fā)現(xiàn)當溶劑為乙醇、甲醇和水時，CHA的提取率分別為4.95%±0.07%、5.6%±0.14%、8.4%±0.28%[40]。由此可知，水的提取率顯著高于乙醇、甲醇，這可能是由于水的介電常數(shù)和極性高于乙醇、甲醇，更有助于微波的吸收，使得CHA能夠更快更好溶出。

2.4 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取的原理是利用超聲波擊碎細胞壁，使細胞內(nèi)組分滲漏到溶液中，從而更快達到分離目的。Pandey等[52]用RSM對超聲輔助提取大黃根莖中酚類化合物的方法進行優(yōu)化后，僅超聲提取30 min CHA的濃度就達到了26.68 mg/g。Chen等[53]也使用RSM優(yōu)化了超聲輔助提取黑枸杞中酚類化合物的方法，在最佳條件下，CHA含量為（6.48±0.16）mg/g。以上研究結(jié)果表明，超聲波輔助提取法不僅縮短了提取時間，還提高了提取效率?？紤]到經(jīng)濟效益和環(huán)境安全，使用水取代提取效率更高的甲醇作為萃取溶劑，發(fā)現(xiàn)超聲輔助萃取獲得的產(chǎn)率幾乎是熱回流萃取方法的兩倍，且能減少溶劑消耗，增加CHA在水中的溶解度[54]。超聲波輔助水提取過程的優(yōu)化，解決了大多數(shù)文獻中提到的常規(guī)技術(shù)缺點，包括提取過程中萃取時間過長導致的CHA降解，提取溫度過高造成的能源浪費，CHA純度偏低引起的回收率低等問題，因此，超聲波輔助水提工藝可以作為傳統(tǒng)提取工藝的環(huán)保安全經(jīng)濟替代方案。

2.5 其他提取方法

除上述提取方法外，綠原酸的提取還涉及到索氏提取法、超高壓提取法、熱回流提取法、酶提取法、超臨界CO2提取等方法。Liu等[55]探索了一種基于離子液體的酶輔助提取CHA的方法，這種方法主要通過纖維素酶分解細胞壁來減少傳質(zhì)壁壘進而獲得高提取率，相較于其他常規(guī)提取技術(shù)，這種新穎的提取方法在產(chǎn)率和效率方面更具優(yōu)勢。金銀花經(jīng)超高壓處理后用乙醇提取，最佳提取條件下的CHA提取率可達4.872%±0.049%[56]，優(yōu)于超聲提取法和熱回流提取法，且能耗低，耗時短。分子印跡技術(shù)是一種可以在形狀、大小和化學功能上創(chuàng)建與模板分子互補的特定空腔從而達到吸附作用的一種技術(shù)。有學者基于此技術(shù)開發(fā)了一種新型親水磁性分子印跡納米粒子進行選擇分離和測定水溶性CHA，這種方法更為有效地從具有相似官能團的共存化合物（咖啡酸、沒食子酸等）中分離出CHA[57]。此外，低共熔溶劑提取、中空纖維固相微萃取和超臨界CO2流體萃取法也可用于植物CHA的提取[41,58-60]。目前低共熔溶劑提取尚未大面積開展應用，中空纖維固相微萃取也仍在起步階段，超臨界CO2流體萃取得率雖高，但技術(shù)工業(yè)化研究較為薄弱且設(shè)備昂貴，發(fā)展較為緩慢[61]。

3 植物綠原酸的抑菌作用

3.1 植物綠原酸的抑菌效果

CHA是一種對病原菌有抑制作用的次生代謝物質(zhì)，對多種病原菌表現(xiàn)出不同的抑制效果（表2）。Lou等[62]研究結(jié)果表明，從牛篣葉中提取的CHA對痢疾志賀氏菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用，且對痢疾志賀氏菌和肺炎鏈球菌的抑菌效果最明顯。李瑞國等[63]提取了甘薯不同器官的CHA，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)甘薯各器官CHA提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌，并進一步確定2.4×106mg/L的甘薯葉提取物的抑菌效果等同于2.5%的慶大霉素（是一種氨基糖苷類藥物，主要用于治療細菌感染）。CHA對病原菌的抑制作用受濃度限制，低濃度的CHA抑菌效果不明顯，而在高濃度下，CHA可完全抑制病原菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長[64]。Cai等[65]的研究表明，CHA對蘋果果汁中的酸酯環(huán)酸桿菌的最低抑菌和最低殺菌濃度分別為2 000 mg/L和4 000 mg/L。此外，CHA與抗菌劑聯(lián)用能有效提高抑菌效果，如3 000 mg/L的CHA與痢菌凈、阿米卡星粘菌素等抗菌藥聯(lián)用能增強抗菌藥對魚源鏈球菌的抑菌作用[66]。

表2 植物綠原酸的抑菌效果Table 2 Antibacterial effects of chlorogenic acid in palnts

CHA除了對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌發(fā)揮抑菌活性外，對一些果實真菌也表現(xiàn)出良好的抑菌效果。Terry等[67]的研究表明，隨著CHA濃度的升高，草莓更不容易受到灰葡萄孢菌的感染。CHA在果實采后病害防控方面也表現(xiàn)出積極作用，150 mg/L的CHA可有效降低梨黑斑病、水蜜桃青霉病、油桃綠霉病、櫻桃以及番茄灰霉病的病情指數(shù)[68]。Jiao等[69]研究表明，25～150 mg/L的CHA能顯著降低桃果實對青霉菌的感病率，同時遭受病原菌侵襲的蘋果果實CHA含量也比健康果實高出5倍，這意味著CHA在抵御病原菌入侵的過程中發(fā)揮著重要作用。此外，從茼蒿中提取的CHA能顯著降低西瓜枯萎病菌菌絲的干重和鮮重，且該抑制作用與CHA濃度呈正相關(guān)[70]。

3.2 綠原酸抑菌機理

眾多研究均表明，CHA在生物學抑菌功能方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。近年來，有關(guān)CHA抑菌機理的研究也有了一定的進展，大致可分為兩個方面（圖2）。一方面，CHA直接抑制病原菌生長。CHA可通過破壞病原菌細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗菌活性[62,73]，如誘導銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）細胞表面凹陷和外膜成分脫落，增加細胞內(nèi)膜通透性，導致胞內(nèi)蛋白泄漏[74]。與常見的由活性氧（ROS）積累引起細菌凋亡的機制相反，CHA通過消耗細菌細胞內(nèi)的ROS，影響信號傳導通路，進而導致細菌凋亡[75]。另有研究表明，牛篣CHA在進入細菌細胞后直接作用于DNA，導致雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，改變細菌DNA構(gòu)象，影響細菌生理功能，最終導致細菌死亡[76]。

圖2 綠原酸抑菌機理Fig.2 Antibacterial mechanism of cholorogenic acid

另一方面，CHA通過提高果實的抗病性抵御病原菌的侵襲。CHA可充當信號分子，通過提高果實的抗氧化酶活性、降低氧化酶活性，來抑制病原菌的入侵和擴展。CHA能夠激活水楊酸的信號通路，誘導桃果實對青霉菌的抗性[69]。焦文曉[68]認為CHA可調(diào)控PAL基因在桃果實中的表達，誘導NPR1和WRKY相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活以及促進下游PRs蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，進而激發(fā)桃果實對病原體的防御反應。此外，CHA還可以通過抑制交替糖的生物合成來抑制交替鏈霉菌在番茄果實中定殖，從而提高番茄的抗病性[77]。綜上所述，CHA不僅可通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)、改變DNA構(gòu)象直接影響病原菌正常生理代謝，還可以通過調(diào)節(jié)代謝途徑、基因表達、信號通路等誘導果實對病原菌產(chǎn)生防御反應。

4 結(jié)論與展望

CHA作為一種水溶性酚類化合物，展現(xiàn)出較強的生物活性和多種藥理作用，在食品、化工、醫(yī)藥和營養(yǎng)保健等方面應用十分廣泛。近年來，有關(guān)CHA的研究已成為天然產(chǎn)物領(lǐng)域的研究熱點，研究內(nèi)容主要涵蓋CHA藥學功能的開發(fā)、天然CHA的提取技術(shù)以及CHA對果蔬的保鮮抑菌等方面。鑒于CHA在提取、果蔬抑菌方面的研究進展，今后有關(guān)植物源CHA的研究可從以下幾方面開展：①以往植物源CHA提取主要采用提取率偏低的單一溶劑浸提法，近年來國內(nèi)外傾向于采用復合提取方法提高CHA的提取率。盡管近年來發(fā)展了微波輔助、超聲波輔助等復合提取方法，但對提取率的提高幅度有限，且CHA有多種異構(gòu)體，還含有不飽和雙鍵等活性基團，傳統(tǒng)提取方法易破壞CHA中的活性基團。為高效提取和富集CHA，有學者基于分子模擬技術(shù)制備出一種能夠特異性識別CHA的分子印跡聚合物，這種分子印跡聚合物有望成為新的研究熱點。今后可在前人研究基礎(chǔ)上繼續(xù)探尋更加經(jīng)濟安全、簡單高效的植物CHA提取方法，使之能夠大規(guī)模應用于工業(yè)提取分離；②植物源CHA能有效抑制由真菌引起的果實腐敗變質(zhì)，這意味著CHA可有效保鮮，提高采后果蔬的品質(zhì)，抑制采后病害的發(fā)生，有望成為一種新的采后果蔬貯藏方法；③CHA在植物病菌防治方面的研究鮮有報道，鑒于植物源CHA對細菌、果實真菌等良好的抑菌效果，以及茼蒿提取CHA能夠抑制西瓜枯萎病菌的佐證，未來可拓展其在更多植物病菌防治上的應用，助力于研發(fā)新型植物源殺菌劑，也為發(fā)展生態(tài)、綠色和環(huán)境友好型的病菌防治手段提供理論基礎(chǔ)。