王 宜，張玉清，吳子薇，方 婷，杜志強(qiáng)，楊彩俠

（長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

相對于哺乳動(dòng)物，雞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。雞ZW 雌性胚胎性腺發(fā)育為不對稱的卵巢，右側(cè)的卵巢分化形成后在后續(xù)孵化期間逐步退化，只保留左側(cè)卵巢繼續(xù)發(fā)育，PGC 位于左側(cè)卵巢的皮質(zhì)區(qū)。反之，ZZ 同型配子的性腺發(fā)育為雙側(cè)對稱的睪丸。雞為卵生，胚胎發(fā)育主要在體外，便于操作，易于獲得，因此，是研究胚胎生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的理想動(dòng)物模型[1]。

褪黑激素（N- 乙酰-5- 甲氧基色胺，Melatonin）是一種內(nèi)源性胺類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，主要在脊椎動(dòng)物松果體中，由前體物質(zhì)色氨酸經(jīng)芳香氨基酸脫羧酶等的作用衍化生成，幾乎存在于所有生物體內(nèi)。在雞胚孵化中，松果腺的發(fā)育始于孵化約60小時(shí)，胚胎第7 天出現(xiàn)可分辨的松果腺細(xì)胞[2]，胚胎第10 天可測量到內(nèi)源褪黑素[3]，胚胎第13 天后，開始有節(jié)律地合成內(nèi)源褪黑素[4]。褪黑素和5- 羥色胺可在禽蛋中形成一個(gè)彌散的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和代謝事件[5]。褪黑素參與多種生理功能，除了調(diào)控生物節(jié)律和發(fā)育代謝外，還影響生殖、腫瘤和衰老等[6]。在嚙齒類動(dòng)物上，褪黑素降低雌性大鼠卵巢重量[7],降低雄性倉鼠睪丸重量[8]。在雞胚上，褪黑素信號(hào)影響眼和心臟的形態(tài)發(fā)生[9]，也拯救低氧誘導(dǎo)的心血管發(fā)育異常[10]。然而，外源褪黑素對雞胚孵化和器官發(fā)育的效應(yīng)缺乏研究。

本研究旨在通過向孵化2.5 天的雞胚卵黃囊內(nèi)注射外源褪黑素，評(píng)價(jià)褪黑素對雞胚孵化、生殖器官發(fā)育和重要內(nèi)臟器官及肌肉發(fā)育的影響效應(yīng)，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料獲得、分組、開孔注射和孵化

540 個(gè)AA 肉雞種蛋購自湯陰縣全達(dá)家禽育種有限公司。種蛋消毒、稱重（53±2g），分成6 組（正常對照、開孔、0.9%生理鹽水、0.17 μmol/L、1.7 μmol/L、17 μmol/L 褪黑素），每組9 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 個(gè)，編號(hào)后放入孵化箱（科裕微電腦全自動(dòng)孵化機(jī)）中孵化。孵化程序如下：1～7 天，溫度參數(shù)37.9℃，濕度參數(shù)50%；8～14 天，溫度參數(shù)37.8℃，濕度參數(shù)55%；15～17 天，溫度參數(shù)37.5℃，濕度參數(shù)65%；18 天之后，溫度參數(shù)37.2℃，濕度參數(shù)70%；孵化全程風(fēng)機(jī)開啟，燈開啟。

孵化2.5 天，正常對照組繼續(xù)孵化，其他五組經(jīng)照蛋確定卵黃囊位置，75%酒精消毒后用迷你小電鉆在氣室端開直徑0.5 mm 的圓孔（圖1），開口組不做注射，直接封口膜封口繼續(xù)孵化，其他四組用1 mL 注射器垂直向下分別注射10 μL 的生理鹽水，0.17 μmol/L、1.7 μmol/L、17 μmol/L 的褪黑素進(jìn)入卵黃囊[9]，注射完畢后封口膜封口繼續(xù)孵化，注射操作半小時(shí)完成。

圖1 種蛋開孔位置及大小

1.2 主要試劑

主要試劑有：褪黑素（貨號(hào)M5250，Sigma），Trizol（貨號(hào)15596026，Thermo），RevertAidFirstStrandcDNA SynthesisKit（貨號(hào)K1622，Thermo），ChamQUniversal SYBRqPCRMasterMix（貨號(hào)Q711-02，諾唯贊）。

1.3 檢測指標(biāo)

分別于孵化第5 天、第9 天和孵化第13 天照蛋并剔除沒受精的蛋，并稱量活胚的蛋重。孵化第17 天稱量活胚的蛋重。從孵化第19.5 天開始每半天統(tǒng)計(jì)每組出雛雛雞個(gè)數(shù)并稱量出雛雛雞重量，直到22 天孵化結(jié)束。分別統(tǒng)計(jì)每組的出殼雞個(gè)數(shù)、未出雛個(gè)數(shù)、出雛雛雞性別。從每組出雛仔雞中隨機(jī)選取10 個(gè)，分離并測量卵巢或睪丸長度，稱量心、肝、脾、胰腺、胸肌、腿肌等重量。

1.4 RT- qPCR 檢測雛雞卵巢抗氧化基因

從0.9%生理鹽水、1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素組出雛雛雞中隨機(jī)選取3 個(gè)，分離左側(cè)卵巢，快速凍存于-80℃。Trizol 提取雛雞卵巢總RNA，檢測RNA 質(zhì)量和濃度，1μg RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA。將cDNA 模板稀釋6 倍，用于熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL。設(shè)計(jì)雞Sod1、Sod2 和Cat 的特異引物（表1），送至上海生工生物工程有限公司合成，無酶水稀釋引物至100 μmol/L，-20℃保存。10 μL反應(yīng)體系：5 μL 的2x ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix，3.6 μL 水，1 μL cDNA，0.4 μL 10 μmol/L上下游引物。PCR 反應(yīng)條件為：95℃10min；95℃15 秒，60℃60 秒，40 循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)技術(shù)重復(fù)孔。Gapdh 作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)量的變化。

表1 RT-qPCR 引物信息

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中百分比數(shù)據(jù)，如孵化率、死亡率、性別比例采用卡方檢驗(yàn)分析，其他數(shù)據(jù)均用單因素方差的LSD 分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P＜0.05 時(shí)指示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 種蛋開孔對雞胚孵化的影響

種蛋開孔組（氣室端，直徑0.5 mm 的圓孔）的雛雞孵化率（60.38%） 與未開孔的正常對照組（79.43%）相比顯著降低（P＜0.05），而種蛋開孔組的種蛋孵化死亡率（39.62%）比正常對照組（20.57%）顯著增加（P＜0.01）（表2）。但是，對于各胚齡活胚蛋重（第5、7、13 和17 天）和雛雞出雛重，開孔組和正常對照組無顯著差異（P＞0.05）。開孔組的雄雛比為50.40%，雌雛比為49.60%，而正常對照組雄雛比為55.92%，雌雛比為44.08%，兩組之間沒有顯著的差異（P＞0.05）（表2）。對于雛雞的出雛時(shí)間，開孔組和正常對照組相比也沒有明顯差別（P＞0.05）（表3）。對于雛雞生殖器官長度和內(nèi)臟器官重量，開孔組與正常對照組相比，卵巢長度、左側(cè)睪丸長度、右側(cè)睪丸長度、心臟重、肝臟重、胰臟重、胸肌重、左腿肌重、右腿肌重均無顯著差異（P＞0.05）,但種蛋開孔孵化的雛雞脾臟重量顯著高于對照組（P＜0.05，表4）。綜合這些數(shù)據(jù)表明，種蛋孵化2.5 天氣室端開直徑0.5mm 的圓孔會(huì)顯著升高后期孵化胚胎的死亡率，降低種蛋的孵化率，增加出雛雛雞脾臟重量而影響雞胚的發(fā)育。

表2 種蛋開口對孵化的影響

表3 開孔對雛雞出雛時(shí)間的影響

表4 種蛋開孔對雛雞生殖和內(nèi)臟器官發(fā)育的影響 （單位：cm、g）

2.2 褪黑素對雞胚孵化和發(fā)育的效應(yīng)

注射0.17 μmol/L、1.7 μmol/L 和17 μmol/L 外源褪黑素組的孵化率分別為51.04%、61.01%和49.14%，相比生理鹽水注射對照組孵化率（48.92%），1.7 μmol/L 褪黑素組孵化率提高12.09%，但各組沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平（P＞0.05，表5）。同樣，對胚胎死亡率、孵化期的胚蛋重/雛雞出雛重和雛雞的性別比例在褪黑素處理組和生理鹽水對照組之間也沒有顯著差異（P＞0.05，表5）。而對于雛雞出雛時(shí)間，0.17 μmol/L 褪黑素組與0.9%生理鹽水對照組相比沒有顯著變化（P＞0.05），1.7 μmol/L 褪黑素組相對對照組出雛時(shí)間顯著推后0.5 到1 天（P＜0.01），17 μmol/L 褪黑素組相對對照組出雛時(shí)間顯著推后1～1.5 天（P＜0.001，表6）。這些數(shù)據(jù)表明，孵化2.5天氣室端開孔注射1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素10 μL 會(huì)顯著推遲雛雞出雛時(shí)間。

表5 褪黑素對雞胚孵化的影響

表6 褪黑素對雛雞出雛時(shí)間的影響

對于雛雞生殖器官長度和內(nèi)臟器官重量，0.17 μmol/L、1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素組與生理鹽水注射對照組相比，卵巢長度、左側(cè)睪丸長度、右側(cè)睪丸長度、心臟重、肝臟重、脾臟重、胸肌重、左腿肌重、右腿肌重均無顯著差異（P＞0.05，表7）, 但17 μmol/L 褪黑素組的雛雞胰臟重量顯著低于生理鹽水對照組（P＜0.05，表7）。綜合這些數(shù)據(jù)表明，種蛋孵化2.5 天氣室端開孔注射1.7 μmol/L和17 μmol/L褪黑素會(huì)顯著推遲雛雞出雛時(shí)間，注射17 μmol/L 褪黑素顯著降低出雛雛雞胰臟重量。

表7 褪黑素對雛雞生殖和內(nèi)臟器官發(fā)育的影響 （單位：cm、g）

2.3 褪黑素對雛雞卵巢氧化應(yīng)激基因表達(dá)的影響

RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示注射1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素對21 胚齡的雞胚卵巢氧化應(yīng)激相關(guān)基因Sod1、Sod2、Cat 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05，表8）。

表8 褪黑素對雛雞卵巢氧化應(yīng)激基因表達(dá)的的影響

3 討論

由于體外孵化發(fā)育給研究處理帶來了便利性，所以雞胚是理想的發(fā)育生物學(xué)研究模型。種蛋導(dǎo)入外源物質(zhì)多采用胚蛋開窗注射技術(shù)[11]。研究表明白萊航家雞種蛋開窗的位置、大小和封口方式等都對孵化率和雞胚發(fā)育有不同程度的效應(yīng)[11]。相對于正常白萊航家雞的平均出殼率85.0%，氣室端開窗大幅度降低平均出殼率到61.0%[11]。本研究結(jié)果顯示AA 肉雞種蛋正常組孵化率為79.43%，而氣室端開0.5 mm 直徑的圓孔會(huì)顯著降低孵化率到60.38%，與報(bào)道結(jié)果一致[11]。在不影響注射操作的情況下，種蛋開孔越小對雞胚造成的機(jī)械損傷越少[12]。本研究采取在孵化2.5 天種蛋的氣室端開0.5 mm 直徑圓孔以盡量降低對種蛋的損傷，但是開孔組雞胚的死亡率（39.62%） 依然顯著高于正常對照組（20.57%），表明蛋殼的完整性對雞胚的孵化是十分重要的。本研究還發(fā)現(xiàn)，開孔組出雛雛雞脾臟的重量顯著高于正常沒開孔組，證實(shí)了種蛋開孔對雞胚器官發(fā)育的影響。文獻(xiàn)報(bào)道種蛋孵化率隨注射入種蛋中液體的體積增加而明顯下降，因此，在劑量不影響試驗(yàn)結(jié)果的情況下應(yīng)盡可能地減少注射帶入雞胚的外源液體體積[12]。本研究注射10 μL 生理鹽水組的孵化率是48.92%，低于開孔不注射組的60.38%，表明針刺內(nèi)殼膜注射入胚胎10 μL 液體依然會(huì)損傷胚胎，降低孵化率。

褪黑素參與調(diào)控生物節(jié)律、發(fā)育、代謝、生殖、腫瘤和衰老等[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)褪黑素具有抗新冠病毒（Covid-19）的效應(yīng)[13]。補(bǔ)充褪黑素可以拯救低氧誘導(dǎo)的心血管發(fā)育異常[10]、然而，補(bǔ)充外源褪黑素對雞胚孵化和器官發(fā)育的效應(yīng)缺乏研究。本研究結(jié)果表明，與生理鹽水對照組相比，在孵化2.5 天注射10 μL 1.7 μmol/L 和17 μmol/L 褪黑素顯著推遲出雛時(shí)間，而且推遲雛雞出雛時(shí)間與濃度成正比，這是否與褪黑素調(diào)控雞內(nèi)部發(fā)育生物鐘信號(hào)有關(guān)尚需驗(yàn)證。有報(bào)道表明，孵化2 天的雞胚補(bǔ)充外源褪黑素影響雞胚心臟成型和視杯的形成[9],而孵化17 天的雞胚補(bǔ)充外源的褪黑素會(huì)影響周期性的心臟功能[14]。本研究結(jié)果并沒發(fā)現(xiàn)孵化2.5 天注射不同濃度的外源褪黑素影響雛雞心臟的重量，但注射17 μmol/L 褪黑素顯著降低雛雞胰臟的重量。胰腺可以外分泌包含各種消化酶等的胰液，可以消化糖、蛋白質(zhì)和脂肪；胰腺也可以內(nèi)分泌胰島素、胰高血糖素等，進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖以維持機(jī)體的正?；顒?dòng)。因此，在本研究中17 μmol/L 褪黑素誘導(dǎo)的胰腺重量降低可能影響胰臟的分泌功能，從而影響雛雞后續(xù)的代謝和生長。以前的研究也表明，高濃度褪黑素激活胰腺癌細(xì)胞系的線粒體凋亡通路，而低濃度褪黑素阻止凋亡[15]。褪黑素與生殖息息相關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道褪黑素影響雌性大鼠卵巢重量[7]和雄性倉鼠睪丸重量[8]。但是，褪黑素與雞胚的生殖器官發(fā)育聯(lián)系缺乏研究。本研究結(jié)果顯示孵化2.5 天雞胚注射不同濃度的褪黑素對出雛雛雞的卵巢和睪丸長度沒有顯著影響，卵巢和睪丸重量由于太小而無法準(zhǔn)確稱量。進(jìn)一步利用RT-qPCR檢測雛雞左側(cè)卵巢的氧化應(yīng)激基因表達(dá)（Sod1、Sod2、Cat）,結(jié)果顯示孵化2.5 天雞胚注射1.7 μmol/L和17 μmol/L 褪黑素不影響這三個(gè)基因的mRNA 表達(dá)水平。已知褪黑素具有抗氧化功能，能夠改善體外培養(yǎng)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)功能損傷的仔雞卵巢[16]。本研究中褪黑素與生殖器官的發(fā)育和氧化應(yīng)激基因表達(dá)沒有影響可能與褪黑素的濃度、注射時(shí)間和檢測時(shí)間有關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：（1）種蛋開口顯著降低雛雞孵化率, 提高雞胚死亡率和增加雛雞脾臟重;（2）注射1.7 μmol/L 或17 μmol/L 褪黑素顯著延遲雛雞出雛時(shí)間；（3）注射17 μmol/L 褪黑素顯著降低雛雞胰臟重。研究結(jié)果為利用褪黑素改善肉雞孵化性能提供了參考。