趙寶山，孫光蕊，邢志君，張志民，張 旭，梁宗英

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，承德 067000）

肺腺癌是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)病年齡的年輕化趨勢(shì)愈加明顯[1]。肺腺癌具有放化療不敏感、血行轉(zhuǎn)移早的特點(diǎn)，致使患者的總體預(yù)后不佳[2-3]。因此，提高肺腺癌的早期診斷率、發(fā)現(xiàn)評(píng)估預(yù)后的新指標(biāo)和新靶點(diǎn)是肺腺癌治療的重中之重[4-5]。痙攣性截癱20（SPG20）是發(fā)現(xiàn)于肌肉截癱中的基因，其編碼的蛋白在細(xì)胞分裂周期的異常作用與腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性[6]；研究[7-9]表明，SPG20甲基化與結(jié)直腸癌、肝癌和胃癌之間存在密切關(guān)系，并作為早期事件。目前對(duì)于SPG20基因在肺腺癌組織內(nèi)甲基化修飾的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)肺腺癌組織內(nèi)SPG20甲基化水平，探討其甲基化與肺腺癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2018年2月至2019年8月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科進(jìn)行手術(shù)治療的70例原發(fā)肺腺癌患者。其中男性27例，女性43例；≥60歲者38例，<60歲者32例；吸煙患者22例，不吸煙患者48例；按照IASLC第八版制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期[3]：Ⅰ期23例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例；組織學(xué)分級(jí)：高分化4例，中分化58例，低分化8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例。實(shí)驗(yàn)組：70例肺腺癌組織；對(duì)照組：70例正常肺組織（距癌組織＞6 cm，經(jīng)術(shù)后病理鑒定）。

1.2 主要試劑和儀器

甲基化修飾試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）；焦磷酸測(cè)序試劑（CST公司）；DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）；Wizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)（美國(guó)Sigma公司）、2×SYBR qPCR Master Mix（美國(guó)Promega公司）、PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)MJ Research公司）、Real-time PCR儀（MX3000P）（美國(guó)Startagene公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取 取肺腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本100 mg，按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明和步驟分別提取DNA，并采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA含量和純度。提取后-20℃保存DNA。

1.3.2 亞硫酸氫鈉處理 取純化的DNA樣品20μL，以DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對(duì)組織和血清樣本DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。將DNA置于95℃水浴中加熱20 min，再冰浴20 min，置于42℃、濃度為3 mol·L-1的NaOH溶液中溫浴20 min。先加入NaHSO3處理液，50℃恒溫16 h。再添加1 mL 37℃的樹(shù)脂，將混勻后的液體真空抽濾后，以80%異丙醇洗滌，析出DNA，以NaOH、冰乙醇、醋酸鉸沉淀后，以80%乙醇洗滌，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng) 甲基化引物由華大基因設(shè)計(jì)并合成。SPG20甲基化引物：F：5’-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3’；R：5’-CCCCTCAAAATTAAACAACCTTTCTCTACA-3’。反應(yīng)體系為50μL，甲基化的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，50℃退火，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸7 min。

1.3.4 Pyrosequencing的檢測(cè) 2μL反應(yīng)結(jié)合珠加入到96孔PCR反應(yīng)板中，結(jié)合38μL緩沖液、40μL PCR產(chǎn)物；充分混勻后于室溫放置10 min。PCR產(chǎn)物和結(jié)合珠混懸液應(yīng)用真空泵吸取，依次放入乙醇、NaOH及沖洗緩沖液中均5 s。將探頭上結(jié)合珠以及PCR產(chǎn)物放入40μL退火緩沖液中，85℃變性2 min，冷卻到室溫，使模板與引物退火雜交。應(yīng)用Pyrosequencing軟件序列設(shè)計(jì)信息計(jì)算劑量，于試劑艙內(nèi)依次放入底物混合物，酶混合物，4種dNTP（QIAGEN）。將96孔反應(yīng)板和試劑艙放進(jìn)Pyrosequencing檢測(cè)儀（PyroMark Q96 ID，QIAGEN）中進(jìn)行反應(yīng)，Pyro Q-CpG軟件將自動(dòng)分析每一個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。以4個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化改變平均值作為甲基化結(jié)果，以正常肺組織作為對(duì)照組；閾值為對(duì)照組甲基化發(fā)生率平均數(shù)+對(duì)照組樣本標(biāo)準(zhǔn)差×2（18.9）。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)SPG20mRNA的相對(duì)表達(dá)量 將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2△△CT法計(jì)算SPG20mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 免疫組化檢測(cè)SPG20蛋白表達(dá)量 將組織蠟塊4μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡，滴加3%H2O2，室溫放置10 min。破膜后，將切片放入檸檬酸緩沖液，置于微波爐中高溫修復(fù)抗原12 min。切片自然冷卻后，滴加山羊血清，室溫放置20 min進(jìn)行封閉。清洗后，在濕盒中加入一抗（兔抗人SPG20單克隆抗體，1∶1 000）孵育4℃過(guò)夜。室溫條件下，加入二抗（山羊抗兔）孵育30 min。DBA顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)染色程度和著色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)價(jià)計(jì)分（每張切片高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野）；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（A）：無(wú)色（0分），淡黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）。著色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（B）：1分（陽(yáng)性細(xì)胞≤10%），2分（陽(yáng)性細(xì)胞10%～50%），3分（陽(yáng)性細(xì)胞50%～75%），4分（陽(yáng)性細(xì)胞＞75%）。以A+B所得分?jǐn)?shù)作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：0～2分為陰性，3～4分為陽(yáng)性，5～7分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.3.7 Western blot檢測(cè)SPG20蛋白表達(dá)量 提取蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)試計(jì)算樣本蛋白濃度。以蛋白+去離子水120μL中含蛋白900μg，計(jì)算并配制蛋白液120μL，制作電泳蛋白上樣液。按序號(hào)各孔加入電泳蛋白上樣液15μL，留適當(dāng)位置加入預(yù)染Marker。連接電泳裝置，以80 V電壓電泳至蛋白樣品適度進(jìn)入分離膠，電壓轉(zhuǎn)為120 V電泳至Marker分條寬度適度。切取目標(biāo)條帶Marker附近適當(dāng)寬度，按膠大小剪膜，并剪切右上角標(biāo)記膜正面，以正面貼近膠。以正極→濾紙→PVDF膜→膠→濾紙→負(fù)極順序制作“三明治”。4℃、90 V轉(zhuǎn)膜70 min。將PVDF膜取出并移入TBST洗膜液中。用水平搖床搖晃平皿，搖床設(shè)定為80 r·min-1，洗膜5 min。取出膜后置于5%脫脂奶粉TBST溶液中，封閉2 h。用平頭鑷子將膜取出，置于裝有TBST液的平皿中。將水平搖床設(shè)定為80 r·min-1，平皿放在水平搖床上洗膜；每次5～10 min，每次更換TBST液，重復(fù)洗膜3次。按比例孵育一抗（按SPG20抗體1∶1 000；GAPDH抗體1∶1 000），搖勻后，4℃過(guò)夜?？贵w稀釋液為T(mén)BST溶解2.5%脫脂奶粉。次日水平搖床用TBST液快速洗膜3次，每次10 min。按1∶2 000比例混勻后，孵育二抗，室溫孵育2 h。用平頭鑷子將膜取出，置于裝有TBST液的平皿中。將水平搖床設(shè)定為80 r·min-1，平皿放在水平搖床上洗膜；每次5～10 min，每次更換TBST液，重復(fù)洗膜3次。置入暗室顯像系統(tǒng)發(fā)光顯像。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描，根據(jù)灰度值進(jìn)行定量分析。以總蛋白內(nèi)GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參對(duì)照。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/總蛋白中GAPDH蛋白條帶灰度值×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；甲基化水平與表達(dá)量之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌和正常肺組織中SPG20甲基化水平比較

焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果顯示：SPG20基因在肺腺癌和正常肺組織中均可發(fā)生甲基化。肺腺癌組織中甲基化率高于正常肺組織甲基化率（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 肺腺癌和正常肺組織中SPG20甲基化水平比較［例（%）］

2.2 肺腺癌和正常肺組織中SPG20 mRNA表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，70例肺腺癌組織中SPG20mRNA相對(duì)表達(dá)量（1.22±0.47）低于正常肺組織（5.79±1.13）（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1肺腺癌和正常肺組織中SPG20 mRNA表達(dá)量比較

2.3 肺腺癌和正常肺組織中SPG20蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較

免疫組化結(jié)果顯示，SPG20蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)。SPG20在腺癌組織中呈低表達(dá)甚至不表達(dá)，其陽(yáng)性率為24.29%（17/70），而正常肺組織中SPG20則呈高表達(dá)，其陽(yáng)性率高達(dá)68.57%（48/70）。SPG20在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)低于正常肺組織（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 肺腺癌和正常肺組織中SPG20蛋白表達(dá)（HE×40）

2.4 肺腺癌和正常肺組織中SPG20蛋白表達(dá)量比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SPG20在肺腺癌組織中低表達(dá)，其蛋白表達(dá)量（15.78±1.85）%低于正常肺組織（63.14±2.05）%（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 肺腺癌和正常肺組織中SPG20蛋白表達(dá)量比較

2.5 肺腺癌組織中SPG20蛋白表達(dá)與甲基化的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示，在肺腺癌組織中，SPG20蛋白表達(dá)水平與SPG20甲基化呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.457，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌組織中SPG20蛋白表達(dá)與甲基化的相關(guān)性（例）

2.6 肺腺癌組織中SPG20甲基化和臨床病理特征的相關(guān)性

SPG20甲基化水平與肺腺癌TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；與患者性別和年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 肺腺癌組織中SPG20甲基化和臨床病例特征的相關(guān)性

3 討論

肺腺癌是肺癌多種病理類型中最常見(jiàn)的一種，占肺癌發(fā)病率的一半以上[10]。目前針對(duì)肺腺癌患者的手術(shù)、放化療及基因靶向治療雖取得了一定的進(jìn)展，但肺腺癌患者總體預(yù)后仍有待進(jìn)一步提高[11]。肺腺癌的發(fā)生是多個(gè)基因、多個(gè)階段、多個(gè)因素及多種機(jī)制參與的共同結(jié)果[12]。因此，從基因分子學(xué)角度深入分析肺腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制、發(fā)現(xiàn)評(píng)估預(yù)后的新指標(biāo)和新靶點(diǎn)、提高肺腺癌的遠(yuǎn)期存活率是肺腺癌治療的首要任務(wù)。

SPG20基因編碼SPG20多功能蛋白，在細(xì)胞分裂周期中起到關(guān)鍵作用，且其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。SPG20在結(jié)腸癌、食管癌及彌漫大B淋巴瘤組織中均呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)[13-15]。但關(guān)于SPG20在肺腺癌中的表達(dá)情況未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺腺癌中SPG20mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中SPG20mRNA表達(dá)水平高于正常肺組織，提示肺腺癌中SPG20在基因轉(zhuǎn)錄水平上受到了抑制。本研究進(jìn)一步通過(guò)免疫組化和蛋白免疫印跡檢測(cè)SPG20蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中SPG20蛋白呈低表達(dá)，而正常肺組織中則呈高表達(dá)。蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果同免疫組化檢測(cè)結(jié)果一致，提示肺腺癌中SPG20可能在基因轉(zhuǎn)錄水平上受到了抑制，進(jìn)而導(dǎo)致翻譯和合成的蛋白表達(dá)量下降。研究結(jié)果顯示：肺腺癌組織和正常肺組織中SPG20mRNA和蛋白的差異表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其表達(dá)受到抑制的機(jī)制不明確。

DNA甲基化是一種不涉及核苷酸序列變化的、可遺傳的基因表達(dá)方式的共價(jià)修飾，是腫瘤發(fā)生機(jī)制中的表觀遺傳形式之一，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。研究[18-20]證實(shí)，DNA甲基化修飾的紊亂狀態(tài)可能使基因表達(dá)異?；蛘邔?dǎo)致腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移、惡化，最終導(dǎo)致患者死亡。DNA甲基化是生物體中調(diào)控基因表達(dá)的常見(jiàn)方式之一，在肺癌[21]、乳腺癌[22]、膠質(zhì)瘤[23]、卵巢癌[24]等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。SPG20基因發(fā)生甲基化會(huì)造成基因表達(dá)抑制，SPG20蛋白減少或缺失最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。尹建浩等[7]對(duì)結(jié)直腸癌患者糞便中SPG20等基因進(jìn)行了甲基化分析，結(jié)果顯示，SPG20在結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本中呈明顯的高甲基化狀態(tài)，而蛋白則呈低表達(dá)狀態(tài)，這對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷和篩查具有重要意義。Zhou等[8]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在胃癌中通過(guò)甲基化誘導(dǎo)SPG20沉默可以通過(guò)激活EGFR/MAPK通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中SPG20蛋白呈低表達(dá)，但其甲基化水平高于癌旁組織，且SPG20的表達(dá)水平與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)[9]。目前關(guān)于SPG20基因在肺腺癌組織內(nèi)甲基化修飾的研究未見(jiàn)報(bào)道，試圖用逆轉(zhuǎn)SPG20基因甲基化狀態(tài)來(lái)治療肺腺癌的研究更是國(guó)內(nèi)外的空白。本研究通過(guò)檢測(cè)肺腺癌組織中SPG20基因甲基化水平，并分析了甲基化程度與蛋白表達(dá)及患者臨床病例特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肺腺癌組織中SPG20基因發(fā)生了甲基化，且癌組織中SPG20甲基化程度高于正常肺組織，SPG20甲基化程度與蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)合免疫組化和蛋白免疫印跡結(jié)果，提示肺腺癌中SPG20基因的高甲基化抑制了基因的轉(zhuǎn)錄，致使其翻譯、合成的蛋白質(zhì)下降。本研究還發(fā)現(xiàn)，SPG20甲基化程度隨著肺腺癌TNM分期和組織分化程度的增加而逐漸增加，且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SPG20甲基化在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中表達(dá)升高，提示其可能促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞自身的侵襲和遷移能力，進(jìn)而使肺腺癌的惡性程度增強(qiáng)，導(dǎo)致其容易通過(guò)淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。SPG20甲基化可能促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞的無(wú)限制生長(zhǎng)及惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致癌細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，SPG20基因在肺腺癌中表達(dá)降低，而其甲基化程度增高，且其高甲基化狀態(tài)與肺腺癌的分期、分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SPG20基因甲基化調(diào)控在肺腺癌的發(fā)病機(jī)制中可能起著關(guān)鍵作用，但具體調(diào)控的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。在今后研究中可以將SPG20甲基化修飾作為切入點(diǎn)，深入研究其具體致癌機(jī)制，為肺腺癌的基因靶向治療提供新的理論依據(jù)。