劉 磊，袁志會，井 慎

（安徽皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)二科，宿州 234000）

感染性休克是病原微生物侵入機(jī)體后引起的全身炎性反應(yīng)導(dǎo)致的以血管通透性增加，體循環(huán)阻力降低，組織器官低灌注等為主要表現(xiàn)的一種病理狀態(tài)[1]。感染性休克可引起多器官功能衰竭，是危重患者死亡的主要原因[2]。免疫系統(tǒng)失衡是感染性休克并發(fā)多器官功能衰竭和死亡的主要機(jī)制之一[3]，miR-155-5p是程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）/程序性死亡配體1（PD-L1）的潛在上游調(diào)控miRNA，參與免疫、炎性反應(yīng)以及T細(xì)胞分化發(fā)育，具有多重免疫調(diào)節(jié)作用[4]。血小板反應(yīng)蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）是存在于血小板α顆粒中的一種同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，具有促使內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移和生長，促進(jìn)血小板聚集、血管生成以及傷口愈合的作用，并能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[5-6]。鑒于miR-155-5p、TSP-1在免疫調(diào)節(jié)中的作用，推測其可能參與感染性休克的發(fā)病機(jī)制，為此本研究擬檢測感染性休克患者血清miR-155-5p、TSP-1變化特點(diǎn)，分析其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年10月至2020年10月安徽皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院收治的142例感染性休克患者為觀察組，其中男性79例，女性63例，年齡35～62歲，平均年齡（51.73±6.15）歲，感染部位：肺部感染52例、腹腔感染49例、胸腔感染27例、泌尿系感染14例。選擇同期安徽皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院體檢的64例健康志愿者為對照組，其中男性39例，女性25例，年齡37～69歲，平均年齡（51.62±6.97）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合感染性休克診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；2）年齡18周歲以上，性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）心源性休克，創(chuàng)傷，燒傷等；2）合并免疫系統(tǒng)疾病和血液系統(tǒng)疾病者；3）中途轉(zhuǎn)院者。以患者入院24 h內(nèi)臨床指標(biāo)（體溫、心率、呼吸等）最差值計(jì)算急性生理與慢性健康評估（APACHE）Ⅱ評分[8]。觀察組與對照組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究已經(jīng)獲得安徽皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2019-12120），所有受試者或其家屬均簽署同意書。

1.2 研究方法

所有受試者入組后均采集肘靜脈血6 mL，注入EDTA抗凝管、干燥試管，干燥試管標(biāo)本經(jīng)離心（4℃，3 000 r·min-1，15 min，半徑10 cm）后取血清，-80℃保存待檢。RT-PCR檢測miR-155-5p表達(dá)：TRIzol法提取總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Epicentre公司）將吸光度值A(chǔ)260/A280 RNA樣品轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的CFX96實(shí)時熒光PCR儀檢測血清中miR-155-5p表達(dá)，引物序列（由上海基康公司完成）：mi R-155-5p上游5’-CCGCGCTTAATGCTAATTG-3’，下 游5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6，上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：95℃變性10 s，65℃退火20 s；75℃延伸15 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算miR-155-5p相對表達(dá)量，共做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。取出血清樣品快速解凍，采用意大利全自動酶免分析儀BIOBASE2000運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測血清TSP-1、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-17、IL-10水平，試劑盒購自上海東方生物科技有限公司?？鼓軜?biāo)本充分混勻，制作外周血單核細(xì)胞懸液，EPICS-XL流式細(xì)胞儀檢測Th17、Treg細(xì)胞占比，計(jì)算Treg/Th17比例。

1.3 臨床治療和結(jié)局

所有患者均給予目標(biāo)導(dǎo)向液體復(fù)蘇，復(fù)蘇目標(biāo)：平均動脈壓≥65 mmHg、尿量≥0.5 mL·（kg·h）-1、中心靜脈血氧飽和度≥70%或混合靜脈血氧飽和度≥65%、中心靜脈壓8～12 mmHg。根據(jù)病原學(xué)診斷結(jié)果選擇使用敏感的抗生素、血管活性藥物（多巴胺、腎上腺素等）維持血壓，氣管插管呼吸機(jī)輔助通氣。根據(jù)患者住院期間是否發(fā)生死亡將患者分為存活組（88例）和死亡組（54例）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，K-S法檢驗(yàn)計(jì)量資料擬合優(yōu)度，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)或Spearman秩相關(guān)分析miR-155-5p、TSP-1水平與T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子以及APACHEⅡ評分的相關(guān)性。受試者工作特征（ROC）曲線分析mi R-155-5p、TSP-1預(yù)測感染性休克患者預(yù)后的價值，檢驗(yàn)ROC曲線下面積（AUC）間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清miR-155-5p、TSP-1、T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

觀察組血清miR-155-5p表達(dá)水平、TSP-1、IL-6、IL-17水平均高于對照組（P均＜0.001），Treg/Th17、TGF-β1、IL-10水平均低于對照組（P均＜0.01），見表1。

表1 兩組患者血清miR-155-5p、TSP-1、T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（x±s）

2.2 不同病情和預(yù)后患者血清miR-155-5p及TSP-1水平比較

APACHEⅡ評分≥15分患者血清miR-155-5p、TSP-1水平均高于APACHEⅡ評分＜15分患者（P均＜0.001），死亡組患者血清miR-155-5p、TSP-1水平均高于存活組（P均＜0.001），見表2、表3。

表2 不同病情患者血清miR-155-5p、TSP-1水平比較（x±s）

表3 不同預(yù)后患者血清miR-155-5p、TSP-1水平比較（x±s）

2.3 mi R-155-5p、TSP-1與APACHEⅡ評分相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-155-5p、TSP-1水平與APACHEⅡ評分均呈正相關(guān)（r=0.506、0.595，P均＜0.05）。

2.4 miR-155-5p、TSP-1水平與T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-155-5p、TSP-1水平與Treg/Th17、TGF-β1、IL-10水平均呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05），與IL-6、IL-17水平均呈正相關(guān)（P均＜0.05），見表4。

表4 miR-155-5p、TSP-1水平與T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子相關(guān)性分析

2.5 miR-155-5p、TSP-1對感染性休克患者預(yù)后的預(yù)測效能

miR-155-5p、TSP-1預(yù)測感染性休克患者院內(nèi)死亡的最佳截斷值分別為1.83 ng·mL-1、179.35 ng·mL-1，AUC分別為0.794、0.799，miR-155-5p聯(lián)合TSP-1預(yù)測感染性休克患者院內(nèi)死亡的AUC為0.912，高于單獨(dú)miR-155-5p和TSP-1（Z=2.426、2.401，P=0.012、0.015），見表5、圖1。

表5 miR-155-5p、TSP-1預(yù)測感染性休克患者預(yù)后的效能

圖1 miR-155-5p、TSP-1預(yù)測感染性休克患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

病原菌感染后炎性反應(yīng)呈“瀑布樣”釋放是感染性休克的主要病因，而免疫系統(tǒng)功能紊亂是誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵，也是感染性休克病情進(jìn)展和預(yù)后不良的關(guān)鍵[9]。病原菌感染誘導(dǎo)的促炎因子、趨化因子和其他因子大量釋放可引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”效應(yīng)，導(dǎo)致免疫功能損傷，表現(xiàn)為免疫功能下調(diào)和免疫麻痹，進(jìn)而造成細(xì)胞和組織損傷甚至多器官功能衰竭[10]?，F(xiàn)有研究[11]顯示，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控固有以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞發(fā)育分化，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，與免疫性疾病發(fā)生有關(guān)。

miR-155-5p前體為B細(xì)胞整合簇，屬于miR-155家族成員之一，在人免疫器官（胸腺、脾臟）以及富含免疫細(xì)胞的器官（肺）中高度表達(dá)，參與T淋巴細(xì)胞分化、細(xì)胞因子生成、免疫監(jiān)管等過程[12-13]。本研究結(jié)果顯示，感染性休克患者血清miR-155-5p表達(dá)增高，且miR-155-5p過表達(dá)與較高的APACHEⅡ評分和院內(nèi)死亡有關(guān)，提示miR-155-5p過表達(dá)參與了感染性休克發(fā)生和病情進(jìn)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p與Treg/Th17、TGF-β1、IL-10水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-6、IL-17水平呈正相關(guān)，提示miR-155-5p可能通過免疫調(diào)控參與感染性休克的發(fā)病機(jī)制。正常情況下，Treg/Th17處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持免疫穩(wěn)定，Treg/Th17失衡可導(dǎo)致機(jī)體過度炎性反應(yīng)和自身免疫疾病發(fā)生。IL-10是抗炎因子，可抑制炎性細(xì)胞激活、遷移和黏附，TGF-β1能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生，抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。IL-6是典型促炎因子，可促使CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，產(chǎn)生IL-17，介導(dǎo)T細(xì)胞炎性反應(yīng)。由此推測，miR-155-5p過表達(dá)可能促使Treg/Th17向Th17偏移，促使Th17細(xì)胞過度活化，合成大量促炎因子，導(dǎo)致機(jī)體過度炎性反應(yīng)，引起血管通透性增加，體循環(huán)阻力降低和組織器官低灌注[14]。TSP-1是調(diào)節(jié)型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白家族成員，由被激活的血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，TSP-1可介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)血小板功能、炎癥、免疫反應(yīng)和突觸修復(fù)等病理生理過程[15]，與創(chuàng)傷性疾病[16]密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，感染性休克患者血清TSP-1水平增高，且TSP-1水平與APACHEⅡ評分呈正相關(guān)，死亡組血清TSP-1水平高于存活組，提示TSP-1參與感染性休克發(fā)生和病情進(jìn)展。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TSP-1水平與Treg/Th17及其細(xì)胞因子間均存在相關(guān)性，提示TSP-1可能通過調(diào)控Treg/Th17分化參與感染性休克發(fā)生。本研究ROC分析結(jié)果顯示，miR-155-5p和TSP-1在感染性休克患者預(yù)后預(yù)測中均有較高價值，而聯(lián)合兩項(xiàng)指標(biāo)有助于提高預(yù)測效能，分析原因?yàn)閙iR-155-5p過表達(dá)且TSP-1水平同時增高，對不良預(yù)后更具警示價值，可為預(yù)后判斷提供更豐富的信息。

綜上所述，感染性休克患者血清miR-155-5p表達(dá)上調(diào)，TSP-1水平增高，均可介導(dǎo)Treg/Th17失衡，參與感染性休克的發(fā)生和病情進(jìn)展。miR-155-5p和TSP-1可作為預(yù)測感染性休克患者預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。