陳靜文， 毛日成， 張繼明

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）被定義為乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）和/或乙肝病毒 （HBV） DNA陽性超過6個月[1]。據(jù)WHO報道[2]，至2015年全球約有2.57億人患有CHB，其中有887 000人死于CHB晚期并發(fā)癥，如肝硬化和肝癌等。因為共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）池的存在，乙肝的治療并不能實現(xiàn)完全治愈，但可以達(dá)到“功能性治愈”[1]，即停止治療后HBsAg仍保持陰性（伴或不伴抗-HBsAg抗體陽轉(zhuǎn)）、HBV DNA檢測不到、肝臟生物化學(xué)指標(biāo)正常，肝組織明顯改善。長期核苷（酸）類似物（NA）治療HBsAg陰轉(zhuǎn)率為0～3%，聚乙二醇干擾素 α（polyethylene glycol interferon α，PEG-IFNα） 單藥治療的HBsAg陰轉(zhuǎn)率為3%～7%[3]，顯然，需要更高效的藥物來降低表面抗原從而實現(xiàn)功能性治愈。本文就HBsAg的結(jié)構(gòu)、功能和近些年研發(fā)的靶向表面抗原的藥物進(jìn)展作一綜述。

已知HBsAg由一組反應(yīng)性抗原決定簇α和亞決定簇dy、wr組成，它們以等位基因?qū)Τ尸F(xiàn)[4]。所以，HBsAg 陽性血清可分為4種主要亞型：HBsAg/adw、HBsAg/ayw、HBsAg/adr和HBsAg/ayr。

1 HBsAg的結(jié)構(gòu)

HBsAg是HBV顆粒的包膜蛋白，具有不同結(jié)構(gòu)域和糖基化狀態(tài)的大（L）、中（M）、小（S）三種蛋白。電子顯微鏡下可以觀察到表面抗原的三種形態(tài)：與空包膜對應(yīng)的直徑22 nm的球形缺陷顆粒、直徑22 nm長度可變的細(xì)絲和直徑42 nm的活性病毒粒子（Dane粒子）。這3種蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中發(fā)生糖基化，它們的合成由提供3個不同長度的羧基末端共線型HBsAg蛋白的單一開放閱讀框指定[5]。小蛋白（226個氨基酸）表達(dá)量最高，在病毒粒子和亞病毒顆粒中占主要成分，并且由于其有與細(xì)胞中宿主來源脂質(zhì)的自組裝的能力，所以在易位過程中不會被切割氨基酸殘基，得以完整分泌。中蛋白（包含pre-S2結(jié)構(gòu)域的55個額外殘基）受相同啟動子調(diào)控，分泌過程也與小蛋白類似。而大蛋白的轉(zhuǎn)錄受特定但較弱的啟動子（pre-S1）調(diào)控。HBV大蛋白（L-HBsAg）包含pre-S2和pre-S1結(jié)構(gòu)域的108-119個附加殘基，是病毒粒子和細(xì)絲的重要組成部分，占包膜蛋白的10%～20 %。但在22 nm球形顆粒中，只占了2%[5-6]。小蛋白和大部分的大蛋白通過與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 （heparan sulfate proteoglycan， HSPG） 位點(diǎn)[7]和?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽 （sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP）結(jié)合而具有感染性。

2 HBsAg的功能

2.1 啟動感染過程

從結(jié)構(gòu)上看，HBsAg位于病毒顆粒的最外層，是病毒與細(xì)胞相互作用的前哨， 它們與細(xì)胞表面的受體結(jié)合， 介導(dǎo)了病毒的吸附與侵入[8]。多項研究證實了pre-S1結(jié)構(gòu)域中的肽在膜附著過程中必不可少，這些肽與人肝細(xì)胞膜特異性結(jié)合，并且可以被單克隆抗體抑制[9]。然而，在鑒定出與S-HBsAg蛋白特異性結(jié)合的肝細(xì)胞結(jié)合內(nèi)皮因子Ⅱ后，也提出了S-HBsAg蛋白參與附著[10]。

2.2 包裹病毒成分

HBsAg是HBV顆粒的包膜蛋白，它可以結(jié)合HBV中和抗體anti-HBsAg，阻止這些抗體對完整病毒顆粒的中和作用，將病毒基因組傳遞給新的細(xì)胞[11]。

2.3 判斷抗病毒治療

HBsAg陽性是乙肝病毒感染的標(biāo)志，臨床上推薦以HBsAg水平來判斷開始PEG-IFNα治療的時機(jī)。指南中介紹[1]，對NA經(jīng)治CHB患者中符合條件的優(yōu)勢人群聯(lián)合PEG-IFNα可使部分患者獲得臨床治愈。治療前HBsAg低水平（＜l 500 IU/mL）及治療中HBsAg快速下降（12周或24周時HBsAg ＜200 IU/mL或下降＞1 lg IU/mL）的患者，聯(lián)合治療后HBsAg陰轉(zhuǎn)的發(fā)生率較高。

2.4 第一代疫苗的基礎(chǔ)

Murphy等[12]利用黑猩猩和被感染的人體血漿接種反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)針對HBsAg交叉反應(yīng)α決定簇的抗體可預(yù)防HBV的adw和ayw亞型。

2.5 免疫調(diào)節(jié)

CD14是促進(jìn)脂多糖（LPS）結(jié)合和Toll樣受體（TLR-4）激活的LPS共受體，有學(xué)者提出HBsAg可能通過與CD14的關(guān)聯(lián)觸發(fā)TLR激活[13]，生化分析表明CD14的依賴性結(jié)合與HBsAg的來源有關(guān)，它改變了亞病毒顆粒的脂質(zhì)分布[14]。更有研究發(fā)現(xiàn)[15]，HBV可通過其編碼的HBsAg蛋白抑制TLR2下游的JNK信號通路從而選擇性地抑制白細(xì)胞介素（IL）-12的產(chǎn)生，這從一方面解釋了HBV逃避天然免疫導(dǎo)致持續(xù)感染的原因。

3 靶向表面抗原的藥物

3.1 核酸聚合物 （NAP）

NAP屬于單鏈硫代磷酸酯寡核苷酸（PS-ON）家族，具有廣譜抗病毒活性。硫代磷酸化的結(jié)構(gòu)保護(hù)寡核苷酸免受核酸酶攻擊，同時還促進(jìn)NAP與各種Ⅰ類包膜病毒和其他感染因子的融合糖蛋白中存在的兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)的疏水表面相互作用[16]。NAP的抗病毒作用取決于寡核苷酸的數(shù)量而不是序列，且作用機(jī)制與其兩親性有關(guān)[17]；其選擇性地阻止亞病毒顆粒[16-17]從攜帶 cccDNA 或整合的 HBV DNA[18]的肝細(xì)胞組裝或分泌，從而允許通過宿主介導(dǎo)的免疫激活清除血清中的HBsAg。

3.1.1REP 2139 加拿大Replicor公司在研新藥REP 2139已進(jìn)入臨床Ⅱ期聯(lián)合用藥試驗中。REP 2139是40聚 體PS-ONs，序 列 為（2’OMeA，2’OMe-5-MeC）20，結(jié)構(gòu)上腺苷和胞苷交替，包含所有胞嘧啶的 5-甲基化和所有核糖的 2’O-甲基修飾[19]。

REP 102研究，隨訪了12例患者接受REP 2139-Ca單藥治療的效果，其中9例轉(zhuǎn)為與PEGIFNα或胸腺素α1的短期聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)伴隨著NAP單藥治療，血清HBsAg 降低2～7 lg IU/mL，血清HBV DNA降低3～9 lg拷貝/mL，以及出現(xiàn)血清抗HBsAg 抗體（10～1 712 mIU/mL）[20]。轉(zhuǎn)為聯(lián)合免疫療法的患者中，有8例發(fā)生了HBsAg血清學(xué)清除，停藥后達(dá)到HBV DNA＜116拷貝/mL，所有9例患者在停止治療前都出現(xiàn)了血清抗HBsAg抗體滴度的顯著增加。一項臨床前研究[21]，在慢性鴨HBV（DHBV）感染模型體內(nèi)評估了由REP 2139與富馬酸替諾福韋二吡呋酯 （TDF） 和恩替卡韋 （ETV） 組成的聯(lián)合療法，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)REP 2139與TDF或與TDF和ETV三藥聯(lián)合使用時，鴨的血清HBsAg和HBV DNA的降低速度更快，并且與TDF單藥治療相比，停止治療后未觀察到病毒反彈。REP 301研究納入了乙肝e抗原（HBeAg）陰性、HBV/丁型肝炎病毒（HDV）合并感染的患者，發(fā)現(xiàn)REP 2139-Ca聯(lián)合PEG-IFN的治療實現(xiàn)了HBsAg血清學(xué)清除和抗HBsAg抗體快速升高（高達(dá)86 532 mIU/mL）[18]。此外，HBsAg 已降至＜1 IU/mL 的患者中加用PGE-IFNα前就出現(xiàn)大幅度的轉(zhuǎn)氨酶升高，而且完成治療的患者中取消所有治療后，分別有4/11、6/11和7/11例對HBsAg、HBV DNA 和HDV RNA的功能控制目前可維持2年。401研究中，40例HBeAg陰性的患者先接受24周TDF單藥治療，后被隨機(jī)均勻分配到實驗組（48周TDF + PEG-IFNα +REP2139-Mg 10例/REP 2165-Mg 10例）和對照組（24周TDF + PEG-IFNα治療后轉(zhuǎn)為三聯(lián)療法繼續(xù)治療48周）；治療結(jié)束時，70.6%（35/40）的患者出現(xiàn)HBsAg下降 ＞1 lgIU/mL，67.5%（27/40）的患者HBsAg ＜1 IU/mL，60%（24/40）患者獲得HBsAg清除（＜0.05 IU/mL），60%（24/40）的患者獲得乙肝表面抗體（HBsAb）陽轉(zhuǎn)；34例患者完成48周隨訪，50% （17/34）的患者HBsAg＜1 IU/mL，41% （14/34）的患者獲得HBsAg清除（＜0.05 IU/mL），50% （17/34）患者出現(xiàn)HBsAb陽性[22]。

3.1.2REP 2165 同樣，Replicor公司在研的REP 2165也處于臨床Ⅱ期、與TDF和PEG-IFNα的聯(lián)合用藥試驗狀態(tài)。REP 2165是一種REP 2139類似物，含有3個等距分布在整個聚合物中的未修飾核糖腺苷，單次給藥后，在小鼠和食蟹猴中顯示出與REP 2139相似的血漿清除率和組織分布，但器官和血液中的藥物蓄積減少[23]。REP 2165的設(shè)計目的是通過將2OMe腺苷替換為2OH腺苷來更快地清除序列中的11、21和31位，增加了這些位置對核酸酶攻擊的敏感性。

401研究中的NAP采用了REP 2165-Mg，治療結(jié)束后總共有41% （14/34）的患者獲得HBsAg血 清 學(xué) 清 除[22]。AASLD2020公 布 了TDF聯(lián) 合REP 2165-Mg的無干擾素治療方案在HBV/HDV合并感染的肝硬化患者中進(jìn)行評估的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者對TDF、REP 2165-Mg治療和伴隨的轉(zhuǎn)氨酶驟然升高耐受性良好，同時伴有HDV RNA清除、約3 lg IU/mL的HBsAg 降低和HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，證實了該無干擾素方案治療HBV/HDV合并感染的晚期肝硬化患者是安全有效的[24]。

3.2 其他HBsAg抑制劑

3.2.1GST-HG131 中國福建的廣生堂藥業(yè)股份有限公司在研新藥GST-HG131還處于臨床Ⅰ期，具體試驗結(jié)果尚待公布。EASL2021報告[25]，GST-HG131臨床前特征，顯示在無細(xì)胞毒作用[半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50） ＞100 μmol/L]條件下，能有效抑制HepG2.215細(xì)胞分泌 HBsAg[半數(shù)有效濃度（EC50） =3.4±nmol/L]、HBeAg（EC50=8 nmol/L）和HBV DNA（EC50=3.3±1.7 nmol/L），與恩替卡韋聯(lián)合應(yīng)用時，具有疊加作用。在AAV-HBV小鼠模型中，GST-HG131在給藥28 d后，血清HBsAg呈劑量依賴性下降（約1 lg IU/mL），與替諾福韋聯(lián)合使用可產(chǎn)生疊加活性。GST-HG131耐受性良好，對小鼠體重?zé)o明顯影響。其抗病毒作用機(jī)制包括強(qiáng)烈抑制 HBsAg 分泌，涉及與末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 4B（TENT4B）結(jié)合和抑制[26]，導(dǎo)致 HBV mRNA 的聚腺苷酸化尾部縮短，從而加速其降解。

3.2.2ALG-010133 美國Aligos Therapeutics公司在研新藥ALG-010133處于臨床Ⅰa/Ⅰb期。ALG-010133 是一種抑制S抗原轉(zhuǎn)運(yùn)的寡核苷酸聚合物（STOPS）分子，作用接近于NAP，在體外和CHB的試驗中被發(fā)現(xiàn)可深度抑制HBsAg形成。其作用機(jī)制目前尚未完全闡明，被認(rèn)為是通過與特異性蛋白相互作用來實現(xiàn)降低HBsAg水平，在這個過程起核酸適配體的作用[27]。

3.2.3LP-128 中國廣州麓鵬制藥有限公司在研新藥LP-128的臨床Ⅰ期研究已完成首例志愿者給藥，旨在評估單次給藥和多次給藥的有效性和安全性[28]。其作用主要是減少宿主體內(nèi)HBsAg包裹的乙肝空殼病毒數(shù)，恢復(fù)空殼病毒耗竭的免疫水平。目前還沒有關(guān)于其作用機(jī)制的詳細(xì)報道。

4 表面抗原清除的臨床意義

cccDNA作為穩(wěn)定的病毒復(fù)制中間產(chǎn)物及病毒RNA轉(zhuǎn)錄的模板，是停止抗病毒治療后病毒復(fù)制反彈的主要原因。實際上即使是急性HBV感染治愈后被感染者體內(nèi)的HBV cccDNA也不能被完全消除，研究表明即使急性HBV感染患者治愈數(shù)十年后，如果使用免疫抑制劑等導(dǎo)致免疫功能低下，仍會發(fā)生HBV再激活，由此可見急性HBV感染患者治愈后依然依賴宿主特異性抗HBV的免疫監(jiān)視作用[29]。因此，盡管清除患者體內(nèi)cccDNA是理想的治療終點(diǎn)，但目前仍難以實現(xiàn)，故美國肝病研究協(xié)會（AASLD）和歐洲肝病研究協(xié)會（EASL）提出功能性治愈目標(biāo)，即實現(xiàn)HBsAg清除伴或不伴抗HBsAg抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，而要實現(xiàn)功能性治愈則依賴于恢復(fù)宿主特異性抗病毒免疫功能，以達(dá)到持久控制HBV感染的目的[30]。

5 應(yīng)用和展望

WHO提出2030年全面消滅肝炎包括乙型肝炎和丙型肝炎的目標(biāo)，HBV病毒學(xué)治愈是指根除HBV cccDNA和/或所有感染的肝細(xì)胞，目前仍難以實現(xiàn)，而HBV的功能性治愈的標(biāo)志主要是清除HBsAg伴/不伴抗HBsAg抗體血清學(xué)轉(zhuǎn)換。在研的幾種HBsAg抑制劑報告的臨床試驗結(jié)果十分可觀，降低HBsAg的速度和效率優(yōu)于現(xiàn)有的NA和PEG-IFNα，但是僅降低HBsAg也不能達(dá)到持久的功能性治愈，很有可能會出現(xiàn)病毒學(xué)反跳。隨著降低病毒蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)病毒蛋白降解或加速循環(huán)HBsAg清除等療法及各種免疫相關(guān)療法的發(fā)展，通過不斷探索聯(lián)合治療的方法，未來幾年內(nèi)有望開發(fā)出更高效的實現(xiàn)HBV功能性治愈的療法。